Análisis metabolómico no dirigido por espectrometría de masas para evaluar la influencia del pase celular y el día de procesamiento en el metaboloma de células HepG2 tratadas con distintos fármacos

Abstract

[ES] La metabolómica, comprendida como el estudio de los metabolitos presentes en una muestra biológica, es una disciplina clave en la investigación biotecnológica. La metabolómica aporta una lectura funcional de la bioquímica de las células y se ha convertido en una herramienta muy potente en el análisis del comportamiento biológico de las muestras. Adicionalmente, la metabolómica permite la evaluación de la respuesta celular tras la exposición a diferentes ambientes, sustancias o condiciones de estrés. El objetivo de este proyecto es elucidar los mecanismos de adaptación de la célula tras estos tratamientos y detectar las alteraciones metabólicas generadas por esta clase de procesos.

Las técnicas empleadas en metabolómica presentan gran sensibilidad, una característica fundamental en su área de aplicación. Sin embargo, estas técnicas también presentan elevada variabilidad en los procedimientos experimentales. Esta variabilidad es un inconveniente a la hora de asegurar la reproducibilidad del experimento. La reproducibilidad se refiere a la capacidad de realizar un experimento análogo al anterior y obtener los mismos resultados. La variabilidad proveniente del equipo empleado se puede corregir mediante el empleo de los algoritmos existentes y mediante los estándares internos. Por su parte, la corrección de la variabilidad proveniente del procesamiento diferencial de las muestras resulta más compleja. De hecho, la variabilidad proveniente de las condiciones de cultivo diferenciales en las muestras podría causar mayores variaciones en los resultados que las propias condiciones del estudio. Por tanto, la validez y reproducibilidad del estudio se ven comprometidas por la presencia de esta variabilidad. Actualmente, el aumento de la reproducibilidad es una de las necesidades más apremiantes en los experimentos de metabolómica.

En este estudio, se analiza mediante cromatografía y espectrometría de masas un conjunto de muestras HepG2 obtenidas bajo diferentes condiciones. Estas condiciones incluyen diferentes parámetros como son el número de pase celular, el tiempo de almacenamiento del extracto celular en metanol a -80ºC, el día de procesamiento y la respuesta metabólica al tratamiento con diferentes compuestos. Las conclusiones extraídas de los resultados reflejan los cambios en el metaboloma asociados a los distintos parámetros analizados. El objetivo de los estudios de toxicidad a fármacos por metabolómica radica en comprender las variaciones metabólicas asociadas a un determinado tratamiento. Sin embargo, la extracción de conclusiones puede verse afectada por cambios metabolómicos ajenos al tratamiento en cuestión y que dan lugar a interpretaciones erróneas de los resultados. Por tanto, es importante conocer los diferentes parámetros que aportan variabilidad para tomar medidas que minimicen el impacto de estos factores sobre el metaboloma y que las diferencias observadas sean resultado de la respuesta metabólica a un determinado tratamiento. Por consiguiente, los resultados de este estudio suponen un avance en la mejora de la reproducibilidad de los análisis de metabolómica, identificando los cambios en el metaboloma asociados a factores no relacionados con el objetivo experimental para facilitar la interpretación biológica correcta de los resultados.

[EN] Metabolomics, as a tool for studying the metabolites present in a biological simple, is an essential discipline in biotechnological investigation. Metabolomics provides a functional reading of cell biochemistry and has become a very powerful tool in analyzing the biological behavior of samples. Additionally, metabolomics allows the evaluation of the cellular response after exposure to different environments, substances or stress conditions. The objective of this project is to elucidate the adaptation mechanisms of the cell after these treatments and to detect the metabolic alterations generated by this kind of processes.

The techniques used in metabolomics have great sensitivity, a fundamental characteristic in their area of application. However, these techniques also show high variability in experimental procedures. This variability is a drawback in ensuring the reproducibility of the experiment. Reproducibility refers to the ability to carry out an experiment identical to the previous one and obtain the same results. On one hand, variability from the equipment used can be corrected by existing algorithms and internal standards. On the other hand, the correction of the variability from the differential processing of the sample is more complex. In fact, the variability from the differential culture conditions in the samples could cause greater variations in the results than the study conditions themselves. Therefore, the validity and reproducibility of the study are compromised by the presence of this variability. Increased reproducibility is currently one of the most pressing needs in metabolomics experiments.

In this study, a set of HepG2 samples obtained under different conditions is analyzed by liquid chromatography and mass spectrometry. These conditions include different parameters such as the cell passage number, the storage time of the cell extract in methanol at -80ºC, the processing day and the metabolic response to treatment with different compounds. The conclusions drawn from the results reflect the changes in the metabolome associated with the different parameters analyzed. The goal of metabolomic drug toxicity studies is to understand the metabolic variations associated with a given treatment. However, drawing conclusions may be affected by metabolomic changes unrelated to the treatment in question and leading to misinterpretations of the results. Therefore, it is important to know the different parameters that provide variability to take measures that minimize the impact of these factors on the metabolome and that the observed differences are the result of the metabolic response to a certain treatment. Therefore, the results of this study represent an advance in the improvement of the reproducibility of the metabolomic analyzes, identifying the changes in the metabolome associated with factors unrelated to the experimental objective to facilitate the correct biological interpretation of the results.