Estudio sobre SCAMP5, potencial regulador del canal de potasio KAT1 en Arabidopsis thaliana

Abstract

[ES] La homeostasis iónica celular es imprescindible para el correcto funcionamiento de las plantas. Gracias a ella se mantiene el nivel de pH idóneo y el potencial electroquímico de membrana, se regula el contenido celular de agua, las reacciones químicas en el citosol y la actividad de los enzimas metabólicos, entre otras muchas funciones. Las bombas o canales iónicos son fundamentales para el mantenimiento de la homeostasis iónica celular, ya que regulan procesos clave para la misma, como el transporte selectivo entre los medios intracelular y extracelular. Uno de los iones más relevantes en la fisiología vegetal es el potasio (K⁺): regula procesos y dinámicas celulares fundamentales como la apertura y cierre de estomas, y derivado de ello, la transpiración de la planta, la regulación del flujo de agua, el intercambio de gases y el crecimiento de la planta. En concreto, el proceso de cierre y apertura de estomas consiste en la generación de un flujo de agua en las células colindantes al estoma (células guarda) que varía su turgencia, provocando la apertura o cierre del poro. Este flujo de agua lo desencadena un cambio en el potencial osmótico de membrana provocado por cambios en la concentración de iones y otros solutos (de entre los que destaca el K⁺) en el citosol, a través de canales y bombas iónicas. La proteína de membrana KAT1 es un canal iónico perteneciente a la familia de proteínas rectificadoras de K⁺. Como tal, interviene en la apertura de estomas debido a su presencia en las células guarda y además contribuye en la regulación de la concentración de iones en el citosol celular y los tejidos de la planta, estando implicado en la tolerancia a la salinidad del suelo. Además, se ha observado que en presencia de ácido abscísico (ABA) se produce la endocitosis temporal de KAT1, provocando el cierre de estomas. Sin embargo, se desconocen los mecanismos responsables de su regulación. Con objeto de desarrollar nuevas variedades de plantas con mayor tolerancia y resistencia a la salinidad del suelo, es de especial relevancia conocer cómo son regulados los canales de potasio. En este trabajo se estudiará la proteína SCAMP5, identificada previamente en nuestro laboratorio mediante un screening Split-ubiquitina como candidata a interaccionar con KAT1. Esta proteína pertenece a la familia de proteínas de membrana secretoras SCAMPs (Secretory Carrier Membrane Proteins). Pese no haber sido confirmada aún su función, se han localizado en vesículas de reciclaje, lo que indica que pueden estar interviniendo en la endocitosis o exocitosis de otras proteínas, como podría ser el caso de KAT1. En primer lugar, se estudiará la localización subcelular de SCAMP5, mediante la expresión transitoria en Nicotiana benthamiana de SCAMP5 fusionado con la proteína fluorescente YFP (Yellow Fluorescence Protein). Este estudio no sólo se realizará para cerciorar la localización de SCAMP5, sino también para a través de esta, inferir su función, dado que cada orgánulo puede tener diferentes condiciones químicas, sustratos y otras moléculas que pueden determinar las funciones de las proteínas que alojan. Posteriormente, se estudiará la interacción proteína-proteína de SCAMP5, con la finalidad de confirmar la interacción de SCAMP5 con KAT1 en planta. Para ello, se ha diseñado un ensayo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) in vivo, consistente en unir la secuencia codificante de KAT1 y SCAMP5 con fragmentos n-terminal y c-terminal de YFP para su expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana. De este modo, si ambas proteínas interaccionaran, se reconstituiría la fluorescencia de YFP, pudiendo ser observable al microscopio confocal. Por último, para su caracterización funcional, se estudiará el efecto de la pérdida de expresión de SCAMP5 en la planta. Para ello, se realizará el genotipado de mutantes de Arabidopsis thaliana por inserción de T-DNA obtenid

[EN] Cellular ionic homeostasis is essential for the proper functioning of plants. Thanks to it, the ideal pH level and the electrochemical membrane potential are maintained. Furthermore, the cellular content of water, the chemical reactions in the cytosol and the activity of metabolic enzymes, among many other functions, are regulated. Ion pumps or channels are essential for the maintenance of cellular ionic homeostasis, since they regulate key processes for it, such as selective transport between intracellular and extracellular media. One of the most relevant ions in plant physiology is potassium (K⁺): it regulates fundamental cellular processes and dynamics such as the opening and closure of stomata, and as a consequence, plant transpiration, regulation of water flow, gas exchange and plant growth. Specifically, the process of closing and opening stomata consists of the generation of a flow of water in the cells adjacent to the stoma (guard cells) that varies their turgidity, causing the pore to open or close. This flow of water is triggered by a change in the membrane osmotic potential caused by changes in the concentration of ions and other solutes (among which K⁺ stands out) in the cytosol, through channels and ion pumps. The KAT1 membrane protein is an ion channel belonging to the K⁺ rectifier protein family. As such, it intervenes in the opening of stomata due to its presence in the guard cells and also contributes to the regulation of the concentration of ions in the cellular cytosol and plant tissues, being involved in tolerance to soil salinity. Furthermore, it has been observed that in the presence of abscisic acid (ABA), temporary endocytosis of KAT1 occurs, causing the closure of stomata. However, the mechanisms responsible for its regulation are unknown. In order to develop new plant varieties with greater tolerance and resistance to soil salinity, it is especially relevant to know how potassium channels are regulated. In this work the SCAMP5 protein, previously identified in our laboratory by means of a Split-ubiquitin screening as a candidate to interact with KAT1, will be studied. This protein belongs to the family of secretory membrane proteins SCAMPs (Secretory Carrier Membrane Proteins). Although their function has not yet been confirmed, they have been located in recycling vesicles, indicating that they may be involved in the endocytosis or exocytosis of other proteins, such as KAT1. Firstly, the subcellular localization of SCAMP5 will be studied through the transient expression in Nicotiana benthamiana of SCAMP5 fused with the fluorescent protein YFP (Yellow Fluorescence Protein). This study will be carried out not only to ascertain the location of SCAMP5, but also to infer its function through it, since each organelle can have different chemical conditions, substrates and other molecules that can determine the functions of the proteins they host. Subsequently, the protein-protein interaction of SCAMP5 will be studied, in order to confirm the interaction of SCAMP5 with KAT1 in the plant. To do this, an in vivo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) assay has been designed, consisting of joining the coding sequence of KAT1 and SCAMP5 with n-terminal and c-terminal fragments of YFP for their transient expression in Nicotiana Benthamiana. In this way, if both proteins interacted, the YFP fluorescence would be reconstituted, making it observable under a confocal microscope. Finally, for its functional characterization, the effect of SCAMP5 expression loss in the plant will be studied. To do this, genotyping of Arabidopsis thaliana mutants by insertion of T-DNA obtained from the SALK collection will be performed.