Transformación genética para la edición de genes de tomate mediante la tecnología CRISPR-Cas

Abstract

[ES] El descubrimiento de nuevos genes implicados en caracteres de interés agronómico puede acelerar el desarrollo de nuevas variedades más eficientes y respetuosas con el medio ambiente. Una de las vías más exitosas para descubrir nuevos genes es el análisis genético de mutantes. En efecto, la identificación y caracterización de un mutante aporta una información valiosa sobre la función del gen mutado, y puede ser el paso previo a la clonación y análisis funcional de dicho gen. En nuestro laboratorio se ha obtenido una colección de más de 7500 líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) y de especies silvestres relacionadas en el contexto de un programa de Mutagénesis Insercional que se está abordando en colaboración con el Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS, Murcia). La caracterización fenotípica de esta colección ha hecho factible la detección de 641 mutantes afectados en caracteres relacionados con el cuajado, desarrollo, maduración y calidad del fruto de tomate o la tolerancia a estrés abiótico en especies silvestres. El análisis de estos mutantes nos está permitiendo identificar algunos de los genes que controlan estos caracteres. Recientemente, los avances en investigación en plantas se han visto impulsados como consecuencia de la puesta a punto de técnicas de edición de genes mediante CRISPR-Cas. Esta metodología, que deriva de un sistema inmune desarrollado a lo largo de la evolución por arqueas y bacterias, permite incorporar mutaciones estables y heredables en lugares precisos de un gen. En el contexto de nuestro programa de Mutagénesis Insercional, el sistema CRISPR permitirá confirmar si el gen clonado a partir de un mutante es responsable de su fenotipo. El principal objetivo de este Trabajo Final de Grado será obtener dos colecciones de plantas transgénicas de tomate (cv. Moneymaker) con el sistema CRISPR-Cas9. Se abordarán las diferentes fases relacionadas con la obtención de las plantas transgénicas y se determinará la eficacia de transformación genética en diferentes etapas del proceso. El objetivo final es evaluar la eficiencia de edición del sistema CRISPR-Cas9 en tomate.

[EN] The discovery of new genes involved in characters of agronomic interest can accelerate the development of new, more efficient, and environmentally friendly varieties. One of the most successful ways to discover new genes is the genetic analysis of mutants. Indeed, the identification and characterization of a mutant provides valuable information on the function of the mutated gene and may be the previous step to cloning and functional analysis of the gene. In our laboratory, a collection of more than 7500 T-DNA lines of tomato (Solanum lycopersicum) and related wild species has been obtained in the context of an Insertional Mutagenesis program that is being addressed in collaboration with Dr. Lozano (University of Almería) and Dr. Bolarín (CEBAS, Murcia). The phenotypic characterization of this collection has made possible the detection of 641 affected mutants in characters related to curdling, development, maturation and quality of tomato fruit ortolerance to abiotic stressinwild species. The analysis ofthesemutantsis allowing usto identify some of the genes that control these characters. Recently, advances in plant research have been driven because ofthe implementation of gene editing techniques using CRISPR-Cas. This methodology, which derives from an immune system developed throughout the evolution by archaea and bacteria, allows to incorporate stable and inheritable mutationsin precise places of a gene. In the context of ourInsertion Mutagenesis program, the CRISPR system will confirm whether the cloned gene from a mutant is responsible for its phenotype. The main objective of this Final Grade Work will be to obtain two collections of transgenic tomato plants(cv. Moneymaker) with the CRISPR-Cas9 system. The different phasesrelated to the production of transgenic plants will be addressed and the efficiency of genetic transformation will be determined at different stages of the process. The last goal is to evaluate the editing efficiency of the CRISPR-Cas9 tomato system.