Human mesenchymal stem cells-derived exosomes as treatment for minimal hepatic encephalopathy induced by chronic liver damage in rats

Abstract

[EN] Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder derived from liver failure, which exhibits symptoms such as motor impairment, personality or mood changes, and even coma in advanced stages. HE cases are classified in 3 types depending on the severity of the symptoms, and are usually preceded by a less acute stage, known as minimal hepatic encephalopathy (MHE). Although many of the patients presenting MHE are not diagnosed due to its relatively mild symptoms (attention deficit, psychomotor slowing¿), it has been proved by numerous studies that this disease severely impacts their quality of life, and their ability to perform in everyday tasks. Liver failure induces HE through two synergistic ways: firstly, liver¿s inability to eliminate toxic substances such as ammonia, derives in the accumulation of these substances in the body (i.e. hyperammonemia). This accumulation can be observed in peripheral tissues as well as in the central nervous system (CNS), and has the potential to affect the activity of this last one. Secondly, liver failure gives rise to peripheral inflammation, which in turn leads to neuroinflammation. This neuroinflammation derives in altered neurotransmission, which causes cognitive and motor impairment. This laboratory has intensely studied this disorder for years, and is currently using a chronic liver disease model based on administration of carbon tetrachloride (CCl4) in rats. The periodic administration of this hepatic toxin to the rodents derives in a chronic progressive liver failure, which goes through all the stages described in humans: steatosis, steatohepatitis and cirrhosis. Furthermore, it shows similar symptoms to HE, including MHE.

Exosomes have been known for years to have the potential to develop into a useful drug delivery mechanism: they are shed and reabsorbed by many cell types, delivering functional molecules to the recipient cell, such as proteins, mRNAs and miRNAs. They are especially promising when it comes to treating brain diseases, as they have no problem crossing the brain-blood barrier.

This project focuses on the study of the use of MSCs-derived exosomes as a treatment for neuroinflammation and related cognitive and motor alterations in CCl4-induced MHE.

Therefore, this work consisted on the evaluation of glial activation (in the cerebellum and hippocampus), the study of membrane expression of neurotransmitter receptor subunits (in the hippocampus), and measuring learning ability and motor impairment. All these studies were performed on 4 groups of rats receiving different treatments: CV (control vehicle), CEX (control + exosome treatment), CC (receiving CCl4) and CCEX (receiving both CCl4 injections and exosome treatment) in order to ascertain the possible activity of exosomes in preventing neuroinflammation.

Results, although not always significant due to the low amount of animals studied, did show an interesting tendency of CCEX group values to differ from those of CC groups, in some cases tending towards normalization. This tendency was present in a more obvious way in glial activation and behavior tests, which revealed the most favorable results for rat groups receiving exosomes. However, as mentioned, symptomatology of HE depends on the interplay of several factors, so further studies should be performed in order to clarify how these effects take place and how they should be employed in order to achieve satisfactory results in the treatment of MHE.

[ES] La encefalopatía hepática (EH) es un trastorno neuropsiquiátrico derivado del fallo hepático, el cual exhibe síntomas tales como problemas de movilidad, cambios de humor y personalidad, e incluso coma en etapas avanzadas. La EH está precedida normalmente por una etapa menos severa, conocida como encefalopatía hepática mínima (EHM). A pesar de que muchos pacientes con EHM no son diagnosticados debido a sus síntomas relativamente suaves (déficit de atención, lentitud psico-motora¿), ha sido probado por numerosos estudios que esta enfermedad afecta a su calidad de vida, así como a su habilidad para llevar a cabo tareas del día a día. El fallo hepático induce esta enfermedad por dos vías que actúan de forma sinérgica: en primer lugar, la incapacidad del hígado para eliminar sustancias tóxicas (siendo ésta una de sus principales funciones) como el amonio, causa la acumulación de dichas toxinas en el cuerpo (hiperamonemia en este caso). Ésta es observable tanto en los tejidos periféricos como en el sistema nervioso central (SNC), y es capaz de afectar a las funciones de éste último por sí sola. En segundo lugar, el fallo hepático acarrea inflamación periférica, la cual produce neuroinflamación, que altera la neurotransmisión y es así la principal causante de los trastornos cognitivos y motores. Este laboratorio ha estudiado extensamente esta enfermedad durante años. Actualmente está utilizando para ello un modelo de daño hepático crónico por administración de tetracloruro de carbono (CCl4) en ratas. La administración crónica de esta hepatotoxina en roedores causa un fallo hepático crónico progresivo, pasando por las diferentes etapas (esteatosis, esteatohepatitis y cirrosis) y presenta importantes similitudes con algunos síntomas de la EH, incluyendo la EHM.

Los exosomas son conocidos desde hace años como una opción prometedora en el campo de la administración dirigida de medicamentos. Esto es debido a que su producción y reabsorción es llevada a cabo por numerosos tipos celulares en el cuerpo, donde liberan moléculas funcionales tales como proteínas, mRNAs y miRNAs. Son especialmente prometedores en lo que respecta al tratamiento de trastornos cerebrales, ya que puede cruzar la barrera hematoencefálica fácilmente, uno de los mayores obstáculos para la administración de medicamentos a este órgano.

Este proyecto consiste en el estudio del uso de exosomas derivados de células madre mesenquimales humanas como tratamiento para reducir la neuroinflamación y las alteraciones cognitivas y motoras en este modelo animal. Así pues, este trabajo ha consistido en la medida de activación glial (en el cerebelo y el hipocampo), el estudio de la expresión en membrana de subunidades de receptores de neurotransmisores (en el hipocampo), y la evaluación de la memoria espacial y habilidad motora. Todos los experimentos se llevaron a cabo sobre 4 grupos de ratas: CV (control), CEX (control recibiendo tratamiento con exosomas), CC (grupo que recibe CCl4), CCEX (grupo que recibe CCl4 y exosomas), con el objetivo de aclarar la posible capacidad de los exosomas para prevenir la neuroinflamación.

Los resultados, aunque no siempre significativos debido al bajo número de animales utilizados, si mostraron una tendencia del grupo CCEX a modificar sus valores con respecto a CC, en algunos casos para acercarlos más a los de CV. Esta tendencia estuvo presente de forma más obvia en la activación glial y los tests de comportamiento, que reflejaron resultados más favorables a los grupos tratados con exosomas. Sin embargo, otros estudios en profundidad serán necesarios para comprender cómo llevan a cabo su acción los exosomas exactamente, y por tanto cómo deberían ser empleados para obtener los mejores resultados en el tratamiento de la EHM.