Estudio de la actividad in vivo de la gentisato-glicosiltransferasa GAGT y la posible glicosiltransferasa Twi1 de tomate mediante expresión transitoria en Nicotiana benthamiana

Abstract

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de interacciones patogénicas incompatibles y su aplicación exógena induce resistencia. Por otra parte, en nuestro laboratorio se identificó el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico), un derivado del SA, como un compuesto fenólico que se acumula en infecciones compatibles no necrotizantes. Su aplicación exógena induce un conjunto de proteínas PR (Pathogenesis-Related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Tanto SA como GA se acumulan en forma de glicósidos. Las reacciones de conjugación consisten en la unión de una o varias moléculas de azúcar al metabolito en cuestión y son catalizadas por glicosiltransferasas. En publicaciones previas, hemos descrito GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) como la proteína que conjuga GA en tomate. Por otra parte, la proteína de tomate Twi1, que se induce en respuesta a herida, interacciones de tipo incompatible y compuestos fenólicos tales como el ácido salicílico (SA), fue identificada como posible glicosiltransferasa, aunque no ha sido caracterizada hasta el momento. En el presente trabajo se ha llevado a cabo la sobreexpresión de GAGT y Twi1 mediante experimentos de expresión transitoria. Para ello, los cDNAs de GAGT y Twi1 han sido clonados en los plásmidos binarios pGWB8 y pGWB9 (tecnología Gateway), respectivamente. Ambos poseen el promotor constitutivo 35S de CaMV y una cola de histidinas en su extremo C-t o N-t. Posteriormente, se ha realizado la agroinfiltración de dichas construcciones, así como de sus correspondientes controles, en hojas de N. benthamiana. La presencia de los transcritos se ha confirmado por RT-PCR. Para el estudio de la actividad in vivo, las plantas agroinoculadas han sido embebidas en soluciones de GA o SA, y posteriormente se han analizado los niveles libres y conjugados de dichos fenólicos mediante HPLC.