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Resumen:
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Las proteínas quinasa identificadas en Saccharomyces cerevisiae Sat4/Hal4 y Hal5 son necesarias para la estabilidad del transportador de K+ y algunas permeasas de aminoácidos y de glucosa. El análisis transcriptómico de ...[+]
Las proteínas quinasa identificadas en Saccharomyces cerevisiae Sat4/Hal4 y Hal5 son necesarias para la estabilidad del transportador de K+ y algunas permeasas de aminoácidos y de glucosa. El análisis transcriptómico de una cepa mutante hal4 hal5 reveló que la ausencia de estos genes origina alteraciones generales en el metabolismo de aminoácidos y de glucosa. Por un lado, se observó una reducción en la toma de metionina y leucina en el mutante hal4 hal5. Esta disminución se correlaciona con una activación de la ruta Gcn2-Gcn4, resultado medida de la expresión del gen lacZ bajo el control del promotor GCN4. Por otro lado, en relación con el metabolismo de la glucosa, se observó que este mutante muestra una derepresión de los genes de la cadena respiratoria en presencia de glucosa, dando lugar a un aumento de la actividad mitocondrial, confirmado por medidas de la actividad succinato deshidrogenasa (SDH). Además, se midió el consumo de glucosa y la producción de etanol de este mutante, observándose también una reducción del flujo glucolítico. Como mecanismo compensatorio para este bajo flujo glucolítico, el mutante hal4 hal5 sobreexpresa el transportador de alta afinidad de glucosa HXT4 y los genes de hexoquinasas. Estos resultados nos indican que el mutante hal4 hal5 presenta defectos en el control general del metabolismo del nitrógeno y el carbono, lo cual se correlaciona con un transporte reducido de aminoácidos y glucosa.
Posteriormente quisimos investigar si esta reducción en la toma de metionina en el doble mutante hal4 hal5 era debida a una desestabilización de la permeasa de alta afinidad Mup1. Observamos, que al igual que se había observado con otras permeasas de la membrana plasmática como Hxt1, Can1, Fur4 y Gap1, la permeasa de metionina se internaliza y se degrada en la vacuola, en ausencia de la suplementación con potasio en el doble mutante indicando que Hal4 y Hal5 están implicadas en un mecanismo general de regulación de las permeasas de la membrana plasmática. Con el objetivo de proseguir en este estudio de la implicación de las quinasas en la regulación de la toma de nutrientes, se estudió su implicación en la ruta de acumulación de permeasas en la membrana plasmática durante su biosíntesis. Los resultados parecen indicar que el doble mutante hal4 hal5 presenta también un defecto en la acumulación de Mup1 en la membrana plasmática y que quizás las quinasas Hal4 y Hal5 también estén implicadas en la regulación de la llegada de Mup1 hacia la membrana, apoyando también el fenotipo observado de ayuno de metionina.
Por otro lado, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, la endocitosis de transportadores de nutrientes requiere su ubiquitinación por parte de la ubiquitín-ligasa Rsp5, que en muchos casos precisa de adaptadores específicos para reconocer la proteína a endocitar. Hasta el momento, se han descrito 19 proteínas posiblemente adaptadoras de Rsp5, entre las que se encuentran 9 proteínas ART: Adaptadores de Tráfico relacionados con Arrestina. En ese trabajo se investiga también el papel de las quinasas Hal4 y Hal5 y la posible implicación de la familia de adaptadores ARTs en el mecanismo de regulación de la permeasa de metionina de alta afinidad Mup1. Con los ensayos genéticos, aunque pudimos confirmar la interacción genética descrita en la literatura entre Mup1 y Art1 así como descartar una redundancia de función entre Art1 y Art2, no fuimos capaces de detectar la interacción física entre el extremo N-terminal del transportador de la membrana Mup1 (pb 1-180) y Art1 Art2, Art3 y Art4, en el sistema de doble híbrido. Por último planteamos la hipótesis de que Art1 fuese el encargado de mediar la internalización de Mup1 en una cepa mutante hal4 hal5, en condiciones de ayuno de potasio, por lo que construimos el triple mutante hal4 hal5 art1. Los resultados de los análisis llevados acabo hasta ahora no son todavía concluyentes, pero nuestros datos iniciales sugerien que Art1 no es necesario para la internalización de Mup1 en el mutante hal4 hal5.
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