Functionality optimization of CRISPR-Cas13d as a new repressor system in Nicotiana Benthamiana

Abstract

[ES] La tecnología CRISPR / Cas es una plataforma valiosa que ha proporcionado herramientas eficientes para la biología sintética de plantas. Varios estudios han intentado dirigirse al ARN empleando sistemas establecidos como Cas9, sin embargo, los resultados obtenidos han sido modestos. El descubrimiento de una nueva nucleasa de tipo VI que se dirige exclusivamente al ARN, llamada Cas13, ha ampliado la caja de herramientas de edición del genoma. Estudios recientes han demostrado que estas nucleasas pueden usarse en eucariotas para la manipulación de ARN similar a Cas9 y Cas12a, las cuales se dirigen a ADN. En plantas, Cas13 se ha utilizado para combatir infecciones virales. Sin embargo, Cas13 se podría emplear para diversas aplicaciones, por ejemplo, como un sistema de represión. Por lo tanto, en presente trabajo, se evaluó y se optimizó la represión de RfxCas13d o CasRx en Nicotiana benthamiana. Nuestros resultados muestran que CasRx es capaz de reprimir genes reporteros y endógenos cuando se realiza un diseño de ARNg adecuado. Además, se obtuvo una mejor represión cuando había múltiples combinaciones de gRNA. Finalmente, la actividad de CasRx depende del objetivo, lo que significa que las complejas estructuras secundarias que se encuentran en el ARNm son una característica clave a tomar en cuenta para una mayor optimización.

[EN] The CRISPR/Cas technology is a valuable platform which has provided efficient tools for plant Synthetic Biology. Despite of diverse studies have reported to target RNA molecules with stablished systems (Cas9), only modest results have been provided. The discovery of a new RNA-targeting type VI CRISPR/Cas nuclease, named Cas13, has expanded the genome-editing toolbox. Recent studies have demonstrated that these nucleases can be used in a similar manner in eukaryotes for RNA manipulation as Cas9 and Cas12 for DNA manipulations. In plants, Cas13 has been used for combating viral infection. However, further potential applications can be done with Cas13, for example, as a repression system. Therefore, in the present workRfxCas13d or CasRx knockdown activity was evaluated and optimized in the Molecular Farming model plant system, Nicotiana benthamiana. Our results show that CasRx is capable to knockdown reporter and endogenous genes when a suitable gRNAs design is done. Moreover, a better repression of reporter and endogenous genes was obtained when multiple gRNAs combinations were present. Also, CasRx activity is target-dependent, which means that the complex secondary structures found in mRNA is a key feature for further optimization.

[CA] La tecnologia CRISPR / Cas és una plataforma valuosa que ha proporcionat ferramentes eficients per a la biologia sintètica de plantes. Diversos estudis han intentat dirigir-se a l'ARN utilitzant sistemes establerts com Cas9, però, els resultats obtinguts han estat modestos. El descobriment d'una nova nucleasa de tipus VI que es dirigeix exclusivament a l'ARN, anomenada Cas13, ha ampliat la caixa de ferramentes d'edició de l'genoma. Estudis recents han demostrat que aquestes nucleases poden usar-se en eucariotes per a la manipulació d'ARN similar a Cas9 i Cas12a, les quals s'adrecen a ADN.En plantes, Cas13 s'ha utilitzat per combatre infeccions virals. No obstant això, Cas13 es podria utilizar per a diverses aplicacions, per exemple, com un sistema de repressió. Per tant, en el present treball, es va avaluar i es va optimitzar la repressió de RfxCas13d o CasRxa la planta model de Molecular Farming, Nicotiana benthamiana.Els nostres resultats mostren que CasRxés capaç de reprimir gens reportersi endògens quan es realitza un disseny de ARNg adequat. A més, es va obtenir una millor repressió quan hi havia múltiples combinacions de ARNg. Finalment, l'activitat de CasRxdepèn de l'objectiu, el que significa que les complexes estructures secundàries que estroben en l'ARNm són una característica clau a tenir en compte per a una major optimització.