Análisis de la proteína supresora del silenciamiento por RNA del virus de las venas amarillas del pimiento 5 (PeVYV-5)

Abstract

[EN] RNA silencing is a sequence-specific gene regulation system that is highly conserved in eukaryotes. In plants, this mechanism plays a very relevant role against exogenous nucleic acids, such as transgenes or viral-type agents. Viruses generate, at some stage in their replicative cycle, double stranded RNA (dsRNA) that activates this type of process. These dsRNAs are recognized by enzymes with RNase III activity, known as DCL (Dicer-like), whose action generates small RNAs (sRNAs) of between 20 and 24 nt. Next, one of the chains of these sRNAs is incorporated into a multiprotein complex called RISC (RNA-induced silencing complex), whose effector molecule is an endonuclease of the Argonaut family (AGO). Once activated, RISC is directed by the sRNA to a complementary sequence RNA, promoting its degradation or repressing translation. To counteract this defensive bar, plant viruses encode proteins known as viral RNA silencing suppressors (VSR), whose mechanisms of action are diverse and complex and in many cases not fully understood. In this work, the possible suppressive activity of the P0 protein of the pepper yellow vein virus 5 (PeVYV-5), a member of the genus Polerovirus (Luteoviridae family) that has been detected in our country and that constitutes a significant threat to the cultivation of peppers. The results obtained have confirmed that the P0 protein of PeVYV-5 is capable of inhibiting RNA silencing, consistent with that observed in other poleroviruses. Additional studies have shown that this protein is localized in the cytoplasm, nucleus and nucleolus and that it forms homodimers in vivo. Since it has recently been described that the P0 protein of some poleroviruses is capable of interacting with AGO1 and inducing its degradation, it was decided to evaluate whether the P0 of PeVYV-5 also interferes with this component of RISC. Using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, no interaction of P0 with AGO1 or AGO4 could be detected, also included in these assays. However, an analysis of the accumulation of AGO proteins in the presence of the P0 protein of PeVYV-5 indicated that this protein could be inducing the degradation of different AGOs, results that could explain the lack of detection of interactions in the BiFC assay. Additional experiments will allow to confirm or refute whether the P0 protein of PeVYV-5 is capable of interacting and inducing the degradation not only of AGO1, as has been proposed for P0 proteins of some members of the Polerovirus genus, but also of other AGO proteins.

[ES] El silenciamiento por RNA es un sistema de regulación génica específico de secuencia que está muy conservado en eucariotas. En plantas, este mecanismo desempeña un papel muy relevante frente a ácidos nucleicos exógenos, como transgenes o agentes de tipo viral. Los virus generan, en alguna etapa de su ciclo replicativo, RNA de doble cadena (double stranded RNA, dsRNA) que activa este tipo de procesos. Estos dsRNA son reconocidos por enzimas con actividad RNasa III, conocidas como DCL (Dicer-like), cuya acción genera pequeños RNA (small RNA) de entre 20 y 24 nt. Seguidamente, una de las cadenas de estos sRNA se incorpora a un complejo multiproteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex), cuya molécula efectora es una endonucleasa de la familia de las Argonautas (AGO). Una vez activado, RISC es dirigido por el sRNA hasta un RNA de secuencia complementaria, promoviendo su degradación o reprimiendo la traducción. Para contrarrestar esta barreta defensiva, los virus de plantas codifican unas proteínas conocidas como supresores del silenciamiento por RNA (viral RNA silencing suppressors, VSR), cuyos mecanismos de acción son diversos y complejos y en muchos casos no se comprenden del todo. En este trabajo se ha analizado la posible actividad supresora de la proteína P0 del virus de las venas amarillas del pimiento 5 (Pepper vein yellows virus 5, PeVYV-5), un miembro del género Polerovirus (familia Luteoviridae) que ha sido detectado en nuestro país y que constituye una amenaza importante para el cultivo del pimiento. Los resultados obtenidos han confirmado que la proteína P0 del PeVYV-5 es capaz de inhibir el silenciamiento por RNA, en consistencia con lo observado en otros polerovirus. Estudios adicionales han mostrado que esta proteína se localiza en citoplasma, núcleo y nucleolo y que forma homodímeros in vivo. Dado que recientemente se ha descrito que la proteína P0 de algunos polerovirus es capaz de interaccionar con AGO1 e inducir su degradación, se decidió evaluar si la P0 del PeVYV-5 también interfiere con este componente de RISC. Mediante ensayos de complementación bimolecular de la fluorescencia (Bimolecular fluorescense complementation, BiFC), no se pudo detectar interacción de P0 con AGO1 ni con AGO4, incluida también en estos ensayos. Sin embargo, un análisis de la acumulación de proteínas AGO en presencia de la proteína P0 del PeVYV-5 indicó que esta proteína podría estar induciendo la degradación de diferentes AGO, unos resultados que podrían explicar la falta de detección de interacciones en el ensayo BiFC. Experimentos adicionales permitirán confirmar o refutar si efectivamente la proteína P0 del PeVYV-5 es capaz de interaccionar e inducir la degradación no solo de AGO1, como ha sido propuesto para proteínas P0 de algunos miembros del género Polerovirus, sino también de otras proteínas AGO.