Optimización de los protocolos de conservación de gametos de anguila europea a corto y largo plazo

Abstract

[ES] La anguila europea (Anguilla anguilla) es una especie de elevado interés pesquero y una de las especies importantes para la acuicultura mundial, pero su producción actual todavía depende de las capturas de angulas del medio natural. Catalogada actualmente como especie en peligro de extinción, la reproducción ex situ se presenta como una pieza clave para su conservación. La maduración en cautividad de esta especie requiere tratamientos hormonales largos y costosos que, en muchas ocasiones, conducen a una maduración asincrónica entre sexos. En este sentido, la optimización de los métodos de almacenamiento de esperma a corto y largo plazo pueden ser un factor clave a la hora de optimizar los procesos de fertilización in vitro. Durante el presente trabajo se llevaron a cabo una serie de experimento con el objetivo de i) mejorar los protocolos existentes de conservación de gametos a corto plazo; y de ii) optimizar los protocolos de criopreservación utilizados en la actualidad. Para el experimento de almacenamiento a corto plazo se probaron diferentes ratios de dilución (1:9 versus 1:49), diferentes temperaturas de almacenamiento (4 °C versus 20 °C), y mantener la muestra en agitación o sin agitación. Las muestras se almacenaron durante 7 días y se evaluaron distintos parámetros cinéticos a diferentes tiempos. Los resultados mostraron que la calidad del esperma no mostró diferencias significativas durante las primeras 24 h entre ambos ratio de dilución. Sin embargo, el ratio de dilución 1:49 mostró mejores resultados en tiempos de almacenamiento superiores. En este sentido, los resultados sugieren que para una conservación mayor de 48 horas es recomendable diluir el esperma a 1:49 y conservarlo a una temperatura de 4 °C. En los experimentos de criopreservación, se evaluaron diferentes viales de congelación (pajuelas versus criotubos), diferentes rampas de congelación y descongelación y, finalmente, diferentes combinaciones de crioprotecotres (methanol, FBS, BSA y yema de huevo). La combinación de metanol (10%) y yema de huevo (5%) como medio de congelación generó los mejores resultados tras la descongelación, y algunas muestras alcanzaron valores de más del 50% de motilidad. Además, también se validó la congelación en viales de grandes volúmenes (criotubos de 2 y 5 ml), sin diferencias significativas con respecto a las muestras criopreservadas pajuelas (0,5 mL). Por tanto, el presente trabajo presenta un método simple para la conservación a corto plazo de esperma de anguila europea durante un máximo de 7 días; y un protocolo de criopreservación que mejora los resultados obtenidos en previos estudios y que es viable aplicarlo en grandes volúmenes para su uso a escala comercial.

[EN] European eel (Anguilla anguilla) is a species of high fishing interest and one of the most important for worldwide aquaculture. However, its current production still depends on the capture of elvers from the wild. Currently catalogued as an endangered species, ex situ reproduction is presented as a key element for its conservation. Maturation in captivity of this species requires long and costly hormonal treatments that, in many cases, lead to an asynchronous maturation between sexes. In consequence, optimization of sperm short-term and long-term storage methods can be a key factor for improving in vitro fertilization processes. During the work, some experiments were carried out with the objective of i) improving the existing short-term gamete conservation protocols; and ii) optimizing the cryopreservation protocols currently used. For the short-term storage experiment, samples were diluted at different ratios (1:9 versus 1:49), were at different temperatures (4 °C versus 20 °C) and were kept in constant agitation or still. Samples were stored for 7 days and different kinetic parameters were evaluated at different times. The results showed that the quality of the sperm did not show significant differences during the first 24 h between both dilution ratio. However, the 1:49 dilution ratio showed better results in longer storage times. In this sense, the results suggest that for longer conservation than 48 hours it is desirable to dilute the sperm at 1:49 and keep it at a temperature of 4 ° C. In the cryopreservation experiments, different freezing vials (straws versus cryotubes), different freezing and thawing ramps and, finally, different combinations of cryoprotectants (methanol, FBS, BSA and egg yolk) we evaluated. The combination of methanol (10%) and egg yolk (5%) as a freezing medium generated the best results after thawing, and some samples reached values of more than 50% of motility. Also, freezing in large volume vials (2 and 5 ml cryotubes) was also validated, without significant differences concerning the cryopreserved straws (0.5 mL) samples. Therefore, the present work shows a simple method for the short-term conservation of European eel sperm for a maximum of 7 days; and a cryopreservation protocol that improves the results obtained in previous studies and that can be applied in large volumes for its use on a commercial scale.