Caracterización en neuronas corticales de una mutación de PRDX3 asociada con una ataxia cerebelosa de inicio infantil

Abstract

[ES] Las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés reactive oxygen species) son el principal agente causante de estrés oxidativo en las células. Aunque están implicados en algunas vías de señalización principalmente relacionadas con la apoptosis, un pequeño incremento en su concentración puede causar graves daños celulares. Por tanto, las células cuentan con varios mecanismos para mantener su concentración estable dentro de un rango.

La principal fuente celular de ROS son las mitocondrias, que se generan fundamentalmente en la cadena de transporte electrónico. Por ello, es importante para la supervivencia celular que existan mecanismos antioxidantes en las mitocondrias, siendo uno de ellos el sistema tiorredoxina 2 (TXN2). Una proteína fundamental en este sistema es la peroxirredoxina 3 (PRDX3), encargada de eliminar las ROS por medio de una reacción de óxido-reducción, en la que esta proteína termina oxidada. Una alteración en esta proteína podría producir la acumulación de especies reactivas de oxígeno, incrementándose así el estrés oxidativo y produciendo daños celulares.

Se detectó en un paciente con atrofia cerebelar una mutación en homocigosis en la proteína PRDX3 (p.D163E). Esta mutación produce una pérdida de función, y un artículo reciente ha asociado mutaciones en PRDX3 con varios casos de atrofia cerebelar. El objetivo de este trabajo es elucidar el fenotipo que causa esta nueva mutación en cultivo primario de neuronas corticales.

Para ello, se transfectaron las neuronas con un plásmido que codifica un constructo bicistrónico (GFP-IRES-PRDX3). Se utilizaron plásmidos codificantes para este constructo con la proteína PRDX3 wild type o la proteína PRDX3 con la mutación p.D163E. Al ser bicistrónico, se asume que la expresión de la proteína de control (GFP) y de la proteína de interés (PRDX3) debe ser similar. Mediante inmunofluorescencia y análisis de imagen se midió y comparó la señal obtenida en el caso de la proteína wild type y la proteína mutante, con el objetivo de determinar si hay diferencias significativas. También se realizó una tinción con MitoTracker para estudiar posibles cambios en las mitocondrias, así como análisis de degeneración de neuritas para detectar procesos de muerte neuronal.

[EN] Reactive oxygen species (ROS) are a major agent producing oxidative stress in cells. Although they are involved in some signaling pathways, mainly apoptotic, a small increase in their concentration can be fatal for cells. Thus, cells have several mechanisms to keep their concentration controlled within a range.

The main source of ROS are mitochondrial pathways, especially the electron transport chain. Therefore, it is crucial for cell survival to have antioxidant mechanisms in mitochondria, being one of them the thioredoxin 2 (TRX2) system. A key protein in this mechanism is peroxiredoxin 3 (PRDX3), which is in charge of controlling ROS concentration by reacting with them, getting itself oxidized as a result. A malfunction of this protein may produce ROS accumulation, therefore increasing oxidative stress and leading to cell damage.

A novel homozygous mutation in PRDX3 (p.D163E) was detected in a patient with cerebellar atrophy. This mutation produces a loss of function, and a recent article has associated several PRDX3 mutations with some cases of cerebellar. The objective of this work is to study the phenotype of primary cortical neurons expressing the mutated protein.

To do so, cortical neurons were transfected with a plasmid that produces a bicistronic construct (GFP-IRES-PRDX3). Plasmids coding for the wild type protein and plasmids coding for the protein with the p.D163E mutation were used. Due to the bicistronic construction, it is assumed that the expression rates of both the reporter protein (GFP) and the protein of interest (PRDX3) should be equivalent. By means of immunofluorescence and image analysis, the signal given by the wild type protein and the mutant protein was compared, with the aim to determine if there are significant differences. MitoTracker was used to stain mitochondria to study possible changes in this organelle produced by this novel mutation, and a degeneration analysis was performed as well to detect neuronal death processes.