Determinación del espectro mutacional de Saccharomyces cerevisiae Y06240 tras diversificación genética mediante evolución experimental: efecto del método de extracción de DNA genómico y método de creación de librerías de DNAseq

Abstract

[ES] La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos modelos que más se usan en Biotecnología y Biomedicina. De hecho, fue el primer eucariota en ser completamente secuenciado. Gracias al avance en secuenciación masiva, se han ido obteniendo cada vez más genomas completos, y se han ido aclarando fenómenos evolutivos complejos. De hecho, en los últimos diez años se ha puesto de manifiesto la importancia que juegan la duplicación génica en la emergencia de nuevas funciones. Saccharomyces cerevisiae es una de las especies de levaduras que se originaron tras un evento de hibridación entre especies hace unos 100 millones de años, que requirieron de una duplicación genómica para volver a ser fértiles. Sin embargo, tras esta duplicación genómica se produjo una rápida reducción del genoma, persistiendo actualmente el 30% del genoma en estado duplicado. Cuáles son los mecanismos moleculares que determinan qué genes se mantienen en duplicado y cuáles no, es uno de los retos que se ha intentado explicar en los proyectos de investigación BFU2015.66073-P y SEJI2018-074. En estos proyectos se ha puesto de manifiesto que el nivel transcripcional de los genes influye en su retención como duplicados, pero tras este largo tiempo evolutivo, se han acumulado mutaciones en cada una de las copias, que ha llevado a una divergencia de secuencia y divergencia funcional que puede estar tras el fenómeno de innovación funcional. Dentro de estos proyectos de investigación se ha generado un conjunto de líneas, procedentes de un ensayo de evolución experimental en que la levadura S. cerevisiae cepa Y06240 se ha sometido a pases diarios aplicando un cuello de botella del 1% en la fase de diversificación (100 pases), y posteriormente, se han generado líneas adaptadas a distintos estreses aplicando un cuello de botella del 10% de la población (durante otros 100 pases). En este TFG se va a: i) estudiar cómo responden estas levaduras evolucionadas ante el estrés oxidativo producido por el medio YPOxD (0.01% H2O2), obteniendo datos de tasa de crecimiento, biomasa producida y otros parámetros de las curvas de crecimiento obtenidas con el Bioscreen c, y analizadas con el correspondiente script en Python y R; y ii) caracterizar el espectro mutacional durante la fase de diversificación (DNAseq a t0 y t100), para ello se determinará el número de SNPs e indels utilizando el programa Breseq, y desarrollando scripts para la comparación de los reads DNAseq comparando dos métodos de extracción de DNA genómico, de generación de las correspondientes librerías DNAseq y de plataforma de secuenciación. Los datos obtenidos se compararán respecto a otra dinámica poblacional (cuello de botella de célula única) realizados previamente, intentando correlacionar los cambios mutacionales con los cambios en el fenotipo medido como tasa de crecimiento o masa generada.

[EN] The yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the most widely used model organisms in Biotechnology and Biomedicine. In fact, it was the first eukaryote to be fully sequenced. Thanks to the advance in massive sequencing, more and more complete genomes have been obtained, and complex evolutionary phenomena have been clarified. In fact, during the past ten years several researchers have shown the importance of gene duplication in the emergence of new functions through the tree of Life. Saccharomyces cerevisiae is one of the yeast species that originated after a hybridization event about 100 million years ago, which required genomic duplication to become fertile again. After whole genome duplication event, there was a rapid reduction of the genome, currently only 30% of the genome persist as duplicate. What are the molecular mechanisms that determine which genes are kept in duplicate and which are not, is one of the challenges that has been tried to explain in the research projects BFU2015.66073-P and SEJI2018-074. In these projects it has been shown that the transcriptional level of genes influences their retention as duplicates, but after this long evolutionary time, mutations have accumulated in each of the copies, which has led to a divergence of sequence and divergence. functional that may be behind the phenomenon of functional innovation. Within these research projects, a set of lines has been generated, from an experimental evolution test in which the yeast S. cerevisiae strain Y06240 has been subjected to daily passages applying a 1% bottleneck in the diversification phase (100 passages), and subsequently, lines adapted to different stresses have been generated by applying a bottleneck of 10% of the population (for another 100 passages). In this TFG we will: i) study how these evolved yeasts respond to the oxidative stress produced by the YPOxD medium (0.01% H2O2), obtaining data on growth rate (r), biomass yield or carrying capacity (k), and other parameters of the growth curves obtained with the Bioscreen c, and analyzed with the corresponding script in Python and R; and ii) characterize the mutational spectrum during the diversification phase of the experimental evolution (DNAseq at t0 and t100), using Breseq to determine the number of SNPs and indels, and developing scripts for the comparison of DNAseq reads comparing two genomic DNA extraction methods, libraries construction, and/or sequencing platform. The data obtained will be compared with other population dynamics (single cell bottleneck) previously carried out, trying to correlate the mutational changes with the changes in the phenotype measured as growth rate or carrying capacity.