Nuevo procedimiento de cultivo primario de astrocitos para evaluar los efectos del etanol en la estimulación de la ruta del receptor TLR4 y sus consecuencias

Abstract

[ES] El alcohol es una droga psicoactiva y neurotóxica cuyo abuso puede provocar alteraciones y lesiones cerebrales, junto con neurodegeneración. Además, su consumo excesivo en patrones de “binge-drinking” entre los jóvenes se ha incrementado en los últimos años, siendo el responsable del 13,5% de muertes en este grupo. Estudios recientes del Laboratorio de Patología Molecular y Celular del Alcohol del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) han puesto de manifiesto el papel del alcohol en la activación de la ruta de los receptores TLR en cultivos de astroglía y microglía. En concreto, el etanol es capaz de estimular la ruta del receptor TLR4, provocando la señalización del factor de transcripción NF-κB y la posterior liberación de citocinas y otros mediadores inflamatorios, tales como TNF-α o IL-1β. Actualmente, los experimentos de investigación utilizan un número elevado de animales de laboratorio, por lo que resulta esencial la necesidad de planificar un buen diseño experimental y reducir el número de modelos animales, sin que esto afecte a la validez y reproducibilidad de los datos. Por tanto, el objetivo de este trabajo comprende la realización de una comparativa entre un protocolo tradicional de cultivo primario de astrocitos con respecto a una implementación de este, basada en el pase de astrocitos. Para ello, el diseño experimental se fundamenta en el análisis de RT-qPCR e inmunofluorescencia de marcadores inflamatorios relacionados con la ruta de estimulación del receptor TLR4, observando sus niveles de expresión en cultivos tratados con etanol y lipopolisacárido (LPS). Los datos preliminares muestran que el etanol altera los patrones de expresión de los marcadores inflamatorios estudiados en el cultivo tradicional, pero no así en los cultivos alternativos, por lo que se puede concluir la necesidad de realizar futuros experimentos para determinar la significancia de los resultados obtenidos y poder implementar los cultivos.

[EN] Alcohol is a psychoactive and neurotoxic drug whose abuse can cause brain alterations and lesions, along with neurodegeneration. Moreover, its excessive consumption in binge-drinking patterns among young people has increased in recent years, being responsible for 13.5% of deaths in this group. Recent studies by the Laboratory of Molecular and Cellular Pathology of Alcohol at the Príncipe Felipe Research Centre (CIPF) have highlighted the role of alcohol in the activation of the TLR receptor pathway in astroglia and microglia cultures. Specifically, ethanol can stimulate the TLR4 receptor pathway, leading to signalling of transcription factor NF-κB and the subsequent release of cytokines and other inflammatory mediators, such as TNF-α o IL-1β. Currently, research experiments use a large number of laboratory animals, making it essential to plan a good experimental design and reduce the number of animal models, without affecting the validity and reproducibility of the data. Therefore, the aim of this work is to compare a traditional protocol for primary astrocyte culture with an implementation based on astrocyte passaging. For this purpose, the experimental design is based on RT-qPCR and immunofluorescence analysis of inflammatory markers related to the TLR4 receptor stimulation pathway, observing their expression levels in ethanol and lipopolysaccharide (LPS)-treated cultures. Preliminary data show that ethanol alters the expression patterns of the inflammatory markers studied in the traditional culture, but not in the alternative cultures, so it can be concluded that future experiments are needed to determine the significance of the results obtained and to implement the cultures.