Estudio sobre dos posibles proteínas reguladoras del canal de potasio KAT1

Abstract

[ES] Todos los seres vivos necesitan servirse de los canales de iones para regular la concentración de iones en el interior y exterior celular. Focalizando en las especies vegetales, el potasio (K+) es el catión más importante debido a que tiene un papel clave en diversos procedimientos celulares como la síntesis proteica, actividad enzimática, regulación de la entrada de agua, etc. De los canales de iones, en concreto de los canales de K+, depende en gran parte la apertura o cierre de los estomas de las células vegetales. Las células oclusivas de los estomas incorporan K+ junto con agua a través de canales, lo que provoca la apertura del estoma. A través de los estomas es por donde se difunden los gases de la fotosíntesis o la respiración de la planta, pero también es por donde se pierde la gran parte del agua presente en la planta en forma de vapor. La manipulación de la apertura o cierre de los estomas podría suponer una estrategia para poder evitar la pérdida de agua en las plantas en condiciones adversas. Este trabajo se centra en el canal de potasio, KAT1, ya que este regula procesos clave en la apertura estomática. Sin embargo, poco se conoce sobre su regulación. Nuestro objetivo es comprobar la interacción entre dos posibles proteínas reguladoras de KAT1 y analizar si dichas proteínas realmente son capaces de regular la función de KAT1. El fin último sería generar plantas resistentes a diferentes condiciones adversas mediante el control de la apertura o cierre de las células oclusivas a través de dichas proteínas reguladoras de KAT1. Para comprobar esto, en primer lugar, hemos realizado un estudio subcelular de la localización de los posibles reguladores con las proteínas de interés fusionadas a GFP. Posteriormente, hemos realizado un ensayo de interacción entre proteínas en planta llamado “Biomolecular fluorescence complementation assay” (BiFC), el cual consiste en la adición de diferentes fragmentos de una proteína fluorescente a cada proteína de interés. Si las construcciones con la proteína de interés interaccionan, los fragmentos se reunifican de nuevo y emiten fluorescencia. Para ello, hemos empleado técnicas de biología molecular, como es el Golden Braid 3.0 para generar las construcciones necesarias. Posteriormente, hemos infiltrado estas construcciones en Nicotiana benthamiana y se han observado al microscopio confocal. Además, hemos transformado plantas de Arabidopsis thaliana salvajes y mutantes knockouts para ambas proteínas de interés con el fin de observar si la localización subcelular de KAT1-GFP varía al no expresarse alguna de las proteínas.

[EN] All living beings need to use ion channels to regulate the concentration of ions inside and outside the cell. Focusing on plant species, potassium (K+) is the most important cation because it plays a key role in various cellular procedures such as protein synthesis, enzymatic activity, regulation of water, etc. The opening or closing of the stomata of plant cells mostly depends on ion channels, specifically K+ channels. The occlusive cells of the stomata incorporate K+ along with water through channels, which causes the opening of the stoma. It is through the stomata where the gases of photosynthesis or respiration of the plant diffuse, but it is also where most of the water present in the plant is lost in vapor form. Controlling the opening or closing of the stomata could be a strategy to avoid water loss in plants in adverse conditions. In the present thesis, we focus on the potassium channel KAT1, since it regulates key processes in stomatal opening. However, little is known about its regulation. Our objective is to verify the interaction between two possible KAT1 regulatory proteins and to analyze whether these proteins are capable of regulating KAT1 function. The goal to achieve would be to generate plants resistant to different adverse conditions by controlling the opening or closing of the occlusive cells through said KAT1 regulatory proteins. To verify this, firstly, we have carried out a subcellular study of the location of the possible regulators with the proteins of interest fused to GFP. Following this, we have carried out an interaction test between plant proteins called ‘’Biomolecular fluorescence complementation assay’’ (BiFC), which consists of adding different fragments of a fluorescent protein to each protein of interest. If the constructions with the proteins of interest interact, the fragments reunite and fluoresce. To do this, we have used molecular biology techniques, such as Golden Braid 3.0 to generate the necessary constructions. Subsequently, we have infiltrated these constructions in Nicotiana benthamiana and they have been observed under a confocal microscope. In addition, we have transformed wild Arabidopsis thaliana plants and knockout mutants for both proteins of interest to observe whether the subcellular localization of KAT1- GFP varies as none of the proteins are expressed.