Preparation plasmid pETHSu for cloning

Abstract

[ES] El plásmido pETHSu es un sistema de expresión de proteínas con un modificador SUMO (similar a la ubiquina) y una etiqueta polihistidina (6xHis) en N-terminal, empleado para la expresión, detección y purificación de proteínas recombinantes en E.coli. SUMO se trata de la proteína Smt3 de Saccharomyces cerevisiae y es miembro de la familia de proteínas similares a ubiquitina, involucradas en funciones celulares como el transporte nuclear, apoptosis y el ciclo celular. El modificador SUMO incrementa la expresión y solubilidad de proteínas recombinantes, y su estructura terciaria puede ser reconocida y escindida por la proteasa SUMO Protease para la obtención de la proteína nativa. DH5ɑ es una cepa competente de E.coli que presenta tres mutaciones características: recA1, endA y lacZΔM15 para una mayor eficiencia de transformación. En este proyecto se llevará a cabo la transformación de células DH5ɑ con el plásmido pETHSu transportando una proteína de interés. Las células serán cultivadas para la amplificación del plásmido y posteriormente el DNA será recuperado y su cantidad y calidad analizada mediante un equipo NanoDrop. El plásmido recuperado será digerido mediante las enzimas Eco31I y NotI y defosforilado. Los productos de reacción serán separados y analizados mediante electroforesis en gel. Finalmente se recuperará el plásmido del gel y se analizará su cantidad y calidad.

[EN] Plasmid pETHSu is a protein expression system with a SUMO (ubiquin-like) modifier and a polyhistidine (6xHis) tag at the N-terminus, which is used for the expression, detection and purification of recombinant proteins in E. coli . SUMO is the Smt3 protein from Saccharomyces cerevisiae and is a member of the family of ubiquitin-like proteins, involved in cellular functions such as nuclear transport, apoptosis, and the cell cycle. The SUMO modifier increases the expression and solubility of recombinant proteins, and their tertiary structure can be recognized and cleaved by the SUMO protease to obtain the native protein. DH5ɑ is a competent E. coli strain that has three characteristic mutations: recA1, endA, and lacZΔM15 for increased transformation efficiency. In this project, the transformation of DH5ɑ cells will be carried out with the plasmid pETHSu carrying a protein of interest. The cells will be cultured for plasmid amplification and later the DNA will be recovered and its quantity and quality will be analyzed using a NanoDrop equipment. The recovered plasmid will be digested by the enzymes Eco31I and NotI and dephosphorylated. The reaction products will be separated and analyzed by gel electrophoresis. Finally, the plasmid will be recovered from the gel and its quantity and quality will be analyzed.