Occurrence and molecular characterization of resistance to QoI fungicides in Plurivorosphaerella nawae, causal agent of circular leaf spot of persimmon

Abstract

[ES] Uno de los principales problemas bióticos que afectan al cultivo de caqui en la Comunidad Valenciana es la enfermedad de la mancha foliar, causada por el Ascomycete Plurivorosphaerella nawae (= Mycosphaerella nawae). El manejo de la enfermedad se basa en gran parte en tratamientos químicos, especialmente con los fungicidas del grupo de los inhibidores de la quinona (QoIs). A medida que los agricultores empezaron a observar una reducción en la eficacia de los fungicidas en 2019, las autoridades decidieron tomar medidas e investigar lo que se consideraba como señales de que P. nawae estaba desarrollando resistencia a los fungicidas. Teniendo en cuenta que los QoIs se describen como fungicidas con alto riesgo inherente de desarrollo de resistencia, este trabajo tuvo como objetivos (i) aislar P. nawae de hojas sintomáticas muestreadas de diferentes zonas de la Comunidad Valenciana, (ii) detectar por medios moleculares la presencia de la resistencia y escalar su prevalencia dentro de la población, y (iii) estimar la sensibilidad de la población al compuesto activo piraclostrobin, uno de los más utilizados para controlar la enfermedad en esta región. Para ello, se sembraron fragmentos de hojas afectadas en medio de cultivo patata dextrosa agar (PDA) con sulfato de estreptomicina, que se incubaron posteriormente para aislar el patógeno. Se obtuvieron colonias puras de hojas sintomáticas de las que se extrajo el ADN genómico para la identificación de la especie fúngica usando cebadores específicos y mediante secuenciación de la región ITS. La resistencia a los fungicidas QoIs se analizó amplificando y secuenciando un fragmento de 223 bp del gen del citocromo b. Para la caracterización de la sensibilidad se obtuvo la concentración capaz de inhibir 50% del crecimiento fúngico, a partir de la exposición de los aislados a concentraciones crecientes de la materia activa. Encontramos que la baja eficacia de los fungicidas QoI para el control de P. nawae en la Comunidad Valenciana está relacionada con una elevada prevalencia de la mutación G143A. La sensibilidad al fungicida piraclostrobin de la población mutante portadora del G143A fue, en promedio, 545 veces más baja que la población de aislados sin esta mutación.

[EN] One of the main biotic problems affecting persimmon in the Valencian Community is the circular leaf spot disease, caused by the Ascomycete Plurivorosphaerella nawae (= Mycosphaerella nawae). Management of the disease relies heavily on chemical treatments, especially with fungicides from the group of quinone outside inhibitors (QoIs). As farmers reported reduced efficacy of fungicides in 2019, authorities decided to take measures and investigate what was being considered as signs of P. nawae developing resistance to the most commonly used fungicide in the region. Bearing in mind that QoIs are described as compounds with inherent high risk of resistance development, this study aimed to (i) isolate P. nawae from symptomatic leaves sampled from different areas throughout the Valencian Community, (ii) detect by molecular methods the presence of resistance and estimate its prevalence in the population, and (iii) calculate population¿s sensitivity to the active compound (pyraclostrobin) most frequently applied to control the disease in the region. For such purposes, pure colonies were obtained from symptomatic leaves. Genomic DNA of each isolate was extracted, and identification of fungal species performed using P. nawae specific primers and sequencing the ITS region. Resistance to QoI fungicides was analyzed amplifying and sequencing a 226-bp fragment of the cytochrome b gene. Sensitivity was calculated with the effective concentration able to inhibit 50% of fungal growth after exposure to increasing concentrations of the active ingredient. We found that the primary cause of the reduced efficacy of the QoI fungicides in the Valencian Community was associated with the great prevalence of the G143A mutation in the P. nawae population. Fungicide sensitivity in the mutant population carrying the G143A was, on average, 545 times lower than the population of wild type individuals.