Bases moleculares de la enfermedad de Wilson y enfermedades Wilson-like

Abstract

[ES] La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno hereditario autosómico recesivo, con una prevalencia de 1/30.000, causado por mutaciones en ATP7B. Este gen codifica para una ATPasa transportadora de cobre, con expresión específica en hígado y cerebro. Se trata de un trastorno multisistémico, con presentación clínica caracterizada por el depósito anormal de cobre como resultado de la deficiencia de ATP7B, siendo lo más frecuente las manifestaciones hepáticas, neurológicas y psiquiátricas.

El diagnóstico diferencial de la EW no es sencillo: la sintomatología es diversa, no todos los pacientes presentan los signos clínicos típicamente asociados y los marcadores indicativos de la acumulación del cobre no son del todo sensibles ni específicos de la patología. La evaluación clínica en los pacientes se basa en la escala de Leipzig, que engloba manifestaciones clínicas y hallazgos de pruebas bioquímicas, pero es el resultado del análisis genético de ATP7B lo que permite establecer un diagnóstico certero de la EW. Algunos pacientes pueden llegar a ser diagnosticados con EW conforme al resultado de aplicar esta escala, pero tras el estudio genético adecuado no se logran identificar en dichos casos mutaciones en ATP7B causantes de la patología. Estos cuadros clínicos, que mimetizan al observado en pacientes con EW al presentar signos y síntomas similares, pero con distinta etiología, se denominan fenotipos Wilson-like.

Identificar los genes implicados en una enfermedad Wilson-like es importante para mejorar el diagnóstico de los pacientes, ya que, en ocasiones, se podría prescribir un tratamiento basado en quelantes de cobre y realmente no padecer la EW. Por ello, en este trabajo se analizarán datos de secuenciación de exoma y genoma completo de casos con fenotipo Wilson-like, a fin de identificar mutaciones candidatas en otros genes que pudieran ser causantes de una clínica coincidente con la EW. A partir del total de variantes registradas en las muestras de interés, se aplicarán distintas estrategias de filtrado y priorización y se llevarán a cabo análisis de segregación en muestra de familiares según disponibilidad. Por último, se completará con estudios funcionales para investigar la posible patogenicidad de variantes candidatas.

Puesto que la EW cuenta con un tratamiento para disminuir y/o evitar la acumulación de cobre en el organismo, alcanzar en los pacientes un diagnóstico temprano es crucial para establecer una pauta terapéutica con quelantes del cobre lo antes posible. De lo contrario, se convierte en un trastorno con mal pronóstico. Actualmente, el seguimiento de los pacientes incluye pruebas bioquímicas (función hepática, parámetros del metabolismo del cobre y hierro en suero y orina) y de imagen (elastografía hepática, resonancia magnética nuclear cerebral) que en la práctica resultan insuficientes para establecer el diagnóstico y limitantes para asegurar adherencia y cumplimentación terapéuticas. En este sentido, existe la necesidad de identificar nuevos marcadores que permitan anticipar la progresión de la enfermedad.

Los microRNAs (miRNAs) son moléculas de 16-22 pb no codificantes que participan en la regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional, altamente conservados evolutivamente y que son liberados en biofluidos como respuesta a procesos fisiológicos, razón por la que son ampliamente investigados como biomarcadores no invasivos en diversas patologías. En estudios previos del laboratorio, se identificó mediante miRNA-seq un listado de miRNAs de interés significativamente desregulados en plasma de pacientes EW, hallazgo también validado mediante PCR cuantitativa (qPCR). Entre ellos destacan tres miRNAs previamente asociados a procesos inflamatorios, metabolismo del hierro y de lípidos. Con el propósito de ahondar en el papel de estos tres miRNAs de interés en el contexto fisiopatológico de la EW, en este trabajo se propone investigar su detección mediante qPCR en muestras de plasma tanto de

[EN] Wilson disease (WD) is an autosomal recessive inherited disorder, with a prevalence of 1/30.000, caused by mutations in ATP7B. This gene encodes for a copper-transporting ATPase with specific expression in liver and brain. It is a multisystemic disorder, with a clinical picture characterized by abnormal copper deposition as a consequence of ATP7B deficiency, with hepatic, neurologic and psychiatric manifestations being the most common.

Differential diagnosis of WD is not simple: symptomatology is diverse, not all the patients present with typical described clinical signs and indicative markers of copper accumulation are not enough sensitive not even specific of the pathology. Clinical evaluation of patients is based on the Leipzig scale, which encompasses clinical manifestations and biochemical test findings; however, it is the result of the genetic analysis of ATP7B that allows a definitive WD diagnosis. Some patients are diagnosed of WD according to the clinical evaluation with the Leipzig scale, but no disease-causing mutations in ATP7B are identified in them. These clinical pictures, which mimic to the described in WD patients by presenting similar signs and symptoms but with different aetiology, are known as Wilson-like phenotypes.

Identifying the genes involved in a Wilson-like disease is important to improve the diagnosis of patients, since, on occasions, a treatment based on copper chelating agents could be prescribed and actually not suffer from WD. Therefore, in this work, exome and genome sequencing data from Wilson-like phenotype cases will be analysed, in order to identify candidate mutations in other genes that could be associated with a clinical picture compatible with WD. Different filtering and prioritization strategies will be applied over the total amount of variants registered in samples of interest. Moreover, segregation analysis will be pursued if familial samples are available. To conclude this part, functional studies will be carried out to investigate pathogenicity of candidate variants.

Since WD has a specific chelation therapy to help reducing and/or preventing copper accumulation in the organism, achieving an early diagnosis is important for setting up a rationale monitoring disease progression plan. Otherwise, it becomes in a disorder with a poor prognosis. Currently, patient s clinical follow-up includes biochemical (liver function, copper and iron metabolism parameters in serum and urine) and imaging tests (transient elastography and brain MRI) but in practice they are insufficient to establish a definitive diagnosis and limiting to assure adherence and compliance to therapy. On this regard, there is an urge to identify new markers that facilitate anticipating disease progression.

MicroRNAs (miRNAs) are evolutionary-conserved non-coding molecules of 16-25 bp which participate in post-transcriptional regulation of gene expression and that are released in biofluids as a response to physiological processes, consequently they are broadly studied as non-invasive biomarkers for a large number of diseases. In previous studies from our laboratory, a list of miRNAs of interest were identified as significantly deregulated in miRNA-seq analysis from WD plasma samples; these findings were also validated by quantitative PCR (qPCR). Among them, three miRNAs previously associated to inflammation, lipid and iron metabolism stand out. With the aim of further explore the role of these three miRNAs in the pathophysiological context of WD, in this work we propose to investigate its detection by qPCR in plasma samples from wild-type and Atp7b-/- mouse model as well as a comparative analysis of registered levels. This will allow to confirm in the WD mouse model the result previously obtained in patients, thus being a starting point for its study in new treatment monitoring and in the discovery of potential therapeutic targets.