Functional and structural characterization of the pathogenic variants p.R1810Q and p.K1556T in the Dihydroorotase domain of the human multi-enzymatic protein CAD.

Abstract

[ES] CAD es una proteína de 243 kDa dividida en cuatro dominios enzimáticos, responsables de catalizar las tres primeras reacciones de la biosíntesis de novo de pirimidinas: Glutaminasa, Carbamil fosfato sintetasa, Aspartato transcarbamilasa y Dihidroorotasa. A pesar de su importancia en el metabolismo de los nucleótidos, no existe información detallada de la estructura ni del funcionamiento de la proteína CAD entera, aunque sí de dos de sus dominios enzimáticos aislados. Estudios anteriores han demostrado que mutaciones bialélicas en CAD son la causa de un grave trastorno metabólico congénito conocido como Encefalopatía Epiléptica y del Desarrollo 50 (DEE50), tratable con suplementos dietéticos de uridina. Este trabajo de fin de grado tiene como objetivo la caracterización funcional y estructural de dos variantes patogénicas clínicas del dominio Dihidroorotasa (DHO) de CAD, p.R1810Q y p.K1556T. Subclonamos el dominio DHO de la CAD humana con la variante patogénica p.R1810Q y expresamos y purificamos la proteína recombinante. Para entender el efecto de la mutación patogénica, caracterizamos el estado oligomérico, la estabilidad y la actividad enzimática de la proteína purificada, y también intentamos su cristalización. Nuestros resultados muestran que la variante DHO p.R1810Q se produce con un rendimiento y solubilidad similares a los de la proteína silvestre y que la mutación no disminuye la actividad o la estabilidad de la proteína. Observamos que la mutación induce una disociación parcial de los dímeros de proteína, y altera las curvas de desnaturalización, lo que, sumado a la reticencia de la proteína a cristalizar, nos lleva a proponer que la mutación R1810Q aumenta la flexibilidad de la extensión C-terminal del dominio DHO que conecta con el dominio ATC. Por tanto, R1810Q podría estar afectando de forma negativa la oligomerización de CAD en una partícula hexámerica funcional. Por otro lado, para clarificar los mecanismos patogénicos de la variante p.K1556T, trazamos y refinamos con éxito la estructura cristalina del dominio DHO con esta mutación a una resolución de 1.8 Å utilizando datos de difracción de sincrotrón. El modelo estructural apoya el papel clave del residuo K1556 en la organización del centro activo y explica el efecto desfavorable de su sustitución por treonina. En general, este proyecto me ha permitido adquirir una visión amplia y práctica de los pasos necesarios para ir de la información génica a la estructura 3D de la proteína, y así comprender el impacto de las mutaciones en su estructura y función.

[EN] CAD is a 243 kDa protein divided into four enzymatic domains, responsible for catalyzing the first three reactions for the de novo pyrimidine biosynthesis: Glutaminase, Carbamoyl phosphate synthetase, Aspartate transcarbamoylase and Dihydroorotase. Despite its importance in nucleotide metabolism, there is no detailed information on the structure or function of the entire CAD protein, although there is information on two of its isolated enzymatic domains. Previous studies have shown that biallelic mutations in CAD are the cause of a severe congenital metabolic disorder known as Developmental and Epileptic Encephalopathy 50 (DEE50), which is treatable with dietary uridine supplementation. This bachelor¿s thesis aims at the functional and structural characterization of two clinical pathogenic variants of the Dihydroorotase (DHO) domain of CAD, p.R1810Q and p.K1556T. We subcloned the DHO domain of human CAD containing the pathogenic variant p.R1810Q and expressed and purified the recombinant protein. To understand the effect of the pathogenic mutation, we characterized the oligomeric state, stability, and enzymatic activity of the purified protein, and we also attempted its crystallization. Our results show that the p.R1810Q DHO variant is produced in a similar yield and solubility as the wild type protein and that the mutation does not decrease the activity or stability of the protein. We observed that the mutation induces partial dissociation of protein dimers, and alters denaturation curves, which, along with the reluctance of the protein to crystallize, leads us to propose that the R1810Q mutation increases the flexibility of the C-terminal extension of the DHO domain which connects with the ATC domain. Therefore, R1810Q could be negatively affecting the oligomerization of CAD into a functional hexameric particle. In addition, to shed light on the pathogenic mechanisms of the p.K1556T variant, we successfully mapped and refined the crystal structure of the DHO domain with this mutation to a resolution of 1.8 Å using synchrotron diffraction data. The structural model supports the key role of residue K1556 in the organization of the active center and explains the unfavorable effect of the replacement by a threonine. Overall, this project has allowed me to gain a broad and practical view of the steps required to go from gene information to the 3D structure of the protein, and thus to understand the impact of mutations on its structure and function.