Efecto de moxifloxacino en la expresión y splicing del gen SMN2 en mioblastos de AME tipo II

Abstract

[ES] La atrofia muscular espinal (AME) es un raro trastorno neuromuscular genético causado por la pérdida de neuronas alfa motoras en los núcleos de la médula espinal y el cerebro. Esta enfermedad afecta a 1 de cada 6.000/10.000 niños, y se caracteriza por la degeneración de las células del asta anterior con una pérdida sustancial de neuronas motoras y debilidad muscular proximal. La denervación de los músculos esqueléticos induce la atrofia, que se ve potenciada por una miopatía primaria. La AME está causada principalmente por mutaciones en el gen SMN1. Sin embargo, como resultado de una duplicación en el genoma, el locus SMN contiene dos copias invertidas de SMN, llamadas SMN1 y SMN2. Los pacientes con AME tienen el gen SMN1 mutado y la copia SMN2 no afectada, que sólo se traduce parcialmente en una proteína SMN funcional. Una de las estrategias terapéuticas se centra en la modulación del splicing de SMN2 para aumentar la inclusión de Ex7 en el transcrito maduro. Se han descrito dos enfoques generales para corregir el patrón de splicing: (1) el uso de ASOs que promueven directamente la inclusión de Ex7 mediante el bloqueo de regiones silenciadoras de splicing exónicas o intrónicas, y (2) el uso de fármacos de moléculas pequeñas que modulan la actividad del spliceosoma en un evento de splicing determinado. La estrategia ASO dio lugar al primer fármaco aprobado por la FDA para la AME tipo 1, llamado nusinersen (Spinraza¿). Sin embargo, todavía hay muchas preocupaciones sobre la administración del fármaco (intratecal) y el coste de la terapia. Aunque la AME afecta sobre todo a las neuronas motoras, las nuevas pruebas muestran que puede ser necesario un restablecimiento sistémico de los niveles de SMN para complementar la terapia con nusinersen. Esto indica que el segundo enfoque, en el que el empalme de SMN2 puede ser modulado por fármacos de moléculas pequeñas, sigue siendo un concepto muy necesario para tratar la AME. En trabajos anteriores, el grupo del Prof. Artero desarrolló un sistema reportero basado en Drosophila sobre la inclusión del exón 7 de SMN2 en la neurona motora. Se utilizó para examinar 1100 moléculas pequeñas aprobadas por la FDA y se seleccionaron 22 resultados primarios que alteran la lectura del sistema reportero y atraviesan la barrera hematoencefálica de Drosophila. De los 11 fármacos seleccionados, descubrieron que tres de ellos aumentan los niveles de proteína SMN en los fibroblastos derivados de pacientes con AME. Uno de los compuestos, el moxifloxacino, se caracterizó como un modulador del splicing que aumenta la inclusión del exón 7 en los fibroblastos derivados de pacientes de AME (Konieczny y Artero 2020). Seguiremos validando este potencial nuevo tratamiento de la AME en un tipo de célula más relevante para la enfermedad. Aquí estudiamos el efecto del moxifloxacino sobre el splicing de SMN2 y los niveles de proteína SMN en mioblastos de AME tipo II. Además, estudiamos si el tratamiento aumenta la formación de gemas, que son el sitio nuclear de acumulación de la proteína SMN. La colocalización de las gemas con los Cuerpos de Cajal es un indicador del buen funcionamiento de la proteína. Las gemas nucleares son difíciles de detectar, y su formación depende de los niveles de expresión basal de SMN y del momento del ciclo celular. También estudiamos si la formación de gemas se ve afectada por moxifloxacino en los mioblastos y durante la formación de los miotubos. Por último, queremos ver si el tratamiento con moxifloxacino puede mejorar el proceso de fusión de los mioblastos al aumentar los niveles de SMN.

[EN] Spinal muscular atrophy (SMA) is a rare genetic neuromuscular disorder caused by loss of αmotor neurons from nuclei in the spinal cord and brain. This disease affects 1 in 6,000/10,000 births. SMA is mainly caused by mutations in the SMN1 gene. However, as a result of duplication in the genome, the SMN locus contains two inverted copies of SMN, called SMN1 and SMN2. SMA patients have the mutated SMN1 gene and the unaffected SMN2 copy, which is only partially translated into a functional SMN protein. One of the therapeutic strategies focuses on the modulation of SMN2 splicing to increase the inclusion of exon 7 in the mature transcript. Two general approaches have been described to correct the splicing pattern: (1) the use of ASOs that directly promote Ex7 inclusion by blocking exonic or intronic splicing silencing regions, and (2) the use of small molecule drugs. that modulate the activity of the spliceosome in a given splicing event. The ASO strategy gave rise to the first FDA-approved drug, called nusinersen (Spinraza™). Even so, there are still many concerns about the administration of the drug (intrathecal) and the cost of therapy. Here we study the effect of moxifloxacin, a small molecule, characterized as a splicing modulator that increases exon 7 inclusion in fibroblasts derived from SMA patients (Konieczny & Artero, 2020) on SMN2 splicing and SMN protein levels. in SMA type II myoblasts. In addition, we studied whether gem formation is affected by moxifloxacin in myoblasts and during myotube formation. Lastly, we want to see if moxifloxacin treatment can enhance the myoblast fusion process by increasing SMN levels. In this trial, it was observed that moxifloxacin increases the expression of the SMN2 gene, thus modulating splicing by increasing the inclusion of exon 7, but a smaller amount of SMN protein is obtained. In addition, gems were detected in DMSO-treated control myoblasts, but gems were not detected in moxifloxacin-treated SMA myoblasts, so no increase in gem formation was seen. And finally, it was seen that moxifloxacin did not produce an improvement in the fusion process of myoblasts.