Estudio del uso del sistema CRISPR-Cas13 para la regulación de la expresión génica in vivo y para aplicaciones de diagnóstico in vitro

Abstract

[ES] Los organismos procariotas presentan sistemas inmunológicos que, guiados por RNA, escinden elementos genéticos desconocidos mediante un sistema basado en repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas agrupadas regularmente (CRISPR) y proteínas asociadas a CRISPR (Cas). Los sistemas CRISPR-Cas se clasifican según la estructura y función de las proteínas Cas en distintos tipos cuya diana es una molécula de DNA, RNA o ambas. El sistema CRISPR-Cas13 se incluye en los sistemas de tipo VI, que llevan a cabo el reconocimiento y degradación del RNA.

Los objetivos que se persiguen en este trabajo son, en primer lugar, caracterizar el silenciamiento de la expresión de la proteína fluorescente superfolder GFP (sfGFP) cuando el RNA diana que escinde Cas13d se encuentra próximo al RNA codificante de dicha proteína y, en segundo lugar, detectar la infección del virus SARS-CoV-2 mediante el sistema CRISPR-Cas13.

Para caracterizar el silenciamiento de la expresión de sfGFP, se requiere realizar la construcción de dos plásmidos que contengan la proteína Cas13d, el RNA guía (gRNA) y un RNA mensajero (mRNA) policistrónico codificante de las proteínas fluorescentes sfGFP (que emite fluorescencia verde) y mScarlet (que emite fluorescencia roja). Ambas proteínas sirven de reporteros. A continuación, se realiza una cotransformación bacteriana de Escherichia coli con ambos plásmidos y al producirse la proliferación celular, se expresa la proteína Cas13d, su RNA guía (que tiene como diana una parte de la secuencia de mScarlet) y los mRNA de sfGFP y mScarlet. El complejo efector formado por Cas13d y el gRNA de mScarlet escinde el mRNA codificante de mScarlet y posiblemente, el mRNA codificante de sfGFP, debido a su actividad nucleasa colateral. Con el estudio de la posible pérdida de la fluorescencia verde, queremos investigar si en un RNA policistrónico se produce la degradación de solo el mRNA para el que Cas13d tiene su diana o, además, debido a su actividad colateral, es también capaz de escindir secuencias codificantes contiguas.

La detección del virus SARS-CoV-2 se realiza de manera indirecta utilizando como diana para el sistema CRISPR-Cas13 un fragmento de tRNA (tRF) que se encuentra sobreexpresado en los sujetos positivos para SARS-CoV-2. Para la detección, se forma un complejo efector de ribonucleoproteína (RNP) formado por el gRNA del tRF y la nucleasa Cas13. Esta RNP reconoce y escinde específicamente el tRF diana y, además, degrada la sonda debido a su actividad colateral inespecífica, dando lugar a la emisión de fluorescencia. La diferencia entre la señal fluorescente de las muestras procedentes de sujetos positivos y negativos para SARS-CoV-2 constituiría una potencial herramienta de diagnóstico de COVID-19.

[EN] Prokaryotic organisms have RNA-guided immune systems that cleave unknown genetic elements using a system based on regularly clustered interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated proteins (Cas). CRISPR-Cas systems are classified according to the structure and function of the Cas proteins into different types that target a DNA molecule, an RNA molecule or both. The CRISPR-Cas13 system is included in the type VI systems, which carry out RNA recognition and degradation.

The aims of this work are, firstly, to characterise the silencing of superfolder GFP (sfGFP) fluorescent protein expression when the target RNA that cleaves Cas13d is close to the RNA coding for this protein and, secondly, to detect SARS-CoV-2 virus infection using the CRISPR-Cas13 system.

To characterise the silencing of sfGFP expression, two plasmids containing the Cas13d protein, the guide RNA (gRNA) and a polycistronic messenger RNA (mRNA) encoding the fluorescent proteins sfGFP (which emits green fluorescence) and mScarlet (which emits red fluorescence) must be constructed. Both proteins serve as reporters. Bacterial co-transformation of Escherichia coli with both plasmids is then carried out and upon cell proliferation, the Cas13d protein, its guide RNA (which targets a part of the mScarlet sequence) and the sfGFP and mScarlet mRNAs are expressed. The effector complex formed by Cas13d and the mScarlet gRNA cleaves the mScarlet coding mRNA and possibly the sfGFP coding mRNA, due to its collateral nuclease activity. By studying the possible loss of green fluorescence, we want to investigate whether in a polycistronic RNA the degradation of only the mRNA for which Cas13d has its target occurs or, in addition, due to its collateral activity, it is also able to cleave contiguous coding sequences.

Detection of SARS-CoV-2 virus is performed indirectly by using a tRNA fragment (tRF) that is overexpressed in SARS-CoV-2 positive subjects as a target for the CRISPR-Cas13 system. For detection, a ribonucleoprotein (RNP) effector complex (RNP) formed by the tRF gRNA and the Cas13 nuclease is formed. This RNP specifically recognises and cleaves the target tRF and, in addition, degrades the probe due to its non-specific collateral activity, resulting in fluorescence emission. The difference between the fluorescent signal of samples from SARS-CoV-2 positive and negative subjects would constitute a potential diagnostic tool for COVID-19.