Caracterización funcional de modificaciones en residuos reguladores del factor de traducción eIF5A2 de A. thaliana

Abstract

[ES] El factor de iniciación de la traducción eucariótico eIF5A es una proteína altamente conservada en eucariotas con capacidad de unión a mRNAs, estando involucrada en la elongación de la traducción y que presenta una modificación post-traduccional única denominada `hipusinación¿ a partir de la poliamina espermidina. eIF5A es una proteína implicada en distintos procesos y vías de señalización en eucariotas, incluyendo regulación de la división, el crecimiento y la muerte celular. eIF5A también recibe otras modificaciones post- traduccionales, como la fosforilación y la acetilación. En Arabidopsis thaliana se han identificado 3 isoformas de eIF5A, y la modificación por hipusinación se ha demostrado que es esencial durante la gametogénesis y participa en otros procesos de desarrollo y respuesta a estrés, si bien el resto de las modificaciones no han sido estudiadas en detalle en plantas. Para profundizar en este conocimiento, en estudios previos en el laboratorio se obtuvieron mutantes puntuales en residuos reguladores del gen eIF5A2 de A. thaliana en la serina-2 (específica para plantas y hongos) y la lisina-48 (acetilable y altamente conservada en eucariotas) generando mutantes eIF5A2 S2A (no fosorilables), eIF5A2 S2D (fosfomiméticos), eIF5A2 K48R (no acetilables) y eIF5A2 K48Q (acetomiméticos) que mostraron alteraciones en el patrón de localización subcelular.

En este trabajo, para avanzar en la caracterización funcional de dichas mutaciones, se generaron plantas transgénicas de A. thaliana sobre-productoras de las distintas variantes de eIF5A2, incluyendo también la versión silvestre de la proteína (eIF5A2 WT), y alogunas presentaron alteraciones en los patrones de tolerancia a estrés. Las líneas transgénicas expresando eIF5A2 S2A presentaban resistencia en la parte aérea de la planta a NaCl y ABA, y sensibilidad a sorbitol en la raíz. Aquellas expresando eIF5A2 S2D presentaban sensibilidad en la parte aérea a NaCl y ABA (crecimiento y germinación). Las líneas transgénicas expresando eIF5A2 K48Q presentaban sensibilidad en la parte aérea a NaCl y ABA (germinación), y resistencia en la raíz a sorbitol. Aquellas expresando eIF5A2 K48R presentaban sensibilidad a ABA (germinación).

Se estudió también la posible implicación de los residuos mutados en la formación de homodímeros mediante estudios de complementación bimolecular fluorescente (BiFC). Sin embargo, se vio que eIF5A2 no contrarresta la tendencia al autoensamblaje que presentan las mitades de la proteína fluorescente, por lo que el método BiFC no es el correcto para estudiar estas posibles diferencias en la homo-dimerización de eIF5A2.

[EN] The eukaryotic translation initiation factor eIF5A is a highly conserved protein among eukaryotes with mRNA binding capacity, being involved in translation elongation and presenting a unique post-translational modification called `hypusination¿ derived from the polyamine spermidine. eIF5A is a protein that operates in different processes and signaling pathways in eukaryotes, including the regulation of cell division, growth, and death. eIF5A also receives several other post-translational modifications, such as phosphorylation and acetylation. There are three identified isoforms of eIF5A in A. thaliana, and the hypusination modification has been proven essential during gametogenesis, being involved in other developmental processes and during stress response, but the other modifications haven¿t been thoroughly studied in plants. To deepen our knowledge in this topic, in previous studies in the lab, point mutants of regulatory residues of the eIF5A2 gene of A. thaliana were obtained, involving the residues of serine-2 (specific for plants and fungi) and lysine-48 (susceptible to acetylation and highly conserved among eukaryotes), generating eIF5A2 S2A (non-phosphorylable), eIF5A2 S2D (phospho-mimetic), eIF5A2 K48Q (aceto-mimetic) and eIF5A2 K48R (non-acetylable) mutants. These mutants showed alterations in their subcellular localization patterns.

In the present study, to advance in the functional characterization of the mutations, A. thaliana transgenic plants that over-expressed the different variants of eIF5A2 were produced, including also the wild-type version of the gene (eIF5A2 WT), and some of them presented alterations in stress tolerance patterns. The transgenic lines expressing eIF5A2 S2A presented aerial resistance to NaCl and ABA, and root sensitivity to sorbitol. Those expressing eIF5A2 S2D presented aerial sensitivity to NaCl and ABA (growth and germination). The transgenic lines expressing eIF5A2 K48Q presented aerial sensitivity to NaCl and ABA (germination), and root resistance to sorbitol. Those expressing eIF5A2 K48R presented germination sensitivity to ABA.

The possible implication of the mutated residues in the formation of homodimers was also tested by bimolecular fluorescent complementation (BiFC) studies. However, it was seen that eIF5A2 doesn¿t abolish the natural tendency to self-assembly of the different fractions of the fluorescent protein, and so BiFC isn¿t the correct method to analyze the homo-dimerization pattern of eIF5A2.