Papel esencial de la proteína biosíntesis de anclaje de glucosilfosfatidilinositol clase F (PIGF) en el control de la placentación temprana

Abstract

[ES] La placenta es un órgano complejo esencial para el intercambio de nutrientes y oxígeno entre la madre y el feto en desarrollo. Así, la placenta dirige el crecimiento y desarrollo del feto. Tenemos pruebas de que la vía de biosíntesis del anclaje del glucosilfosfatidilinositol (GPI) es de especial importancia para el desarrollo temprano de la placenta, lo que conduce a un fenotipo placentario grave en los mutantes que puede ser la causa de la letalidad embrionaria en los ratones. En este estudio investigamos el papel de biosíntesis de anclaje de glucosilfosfatidilinositol GPI clase F (Pigf), en la regulación de la placentación en ratón. Pigf es un gen que codifica una proteína implicada en la biosíntesis de GPI, específicamente en las etapas de transferencia de la etanolamina fosfato (EtNP) de la biosíntesis de GPI. PIGF forma un heterodímero con PIGG o PIGO, dos enzimas que transfieren una EtNP a la segunda y tercera manosa de GPI. Y sin la función estabilizadora de PIGF, tanto PIGO como PIGG se degradarían inmediatamente sin poder ejercer su actividad enzimática, esencial para la formación de GPI. Esta GPI sirve como sitio de anclaje en la membrana para al menos 150 proteínas humanas, lo que sugiere un papel importante para la estabilidad y funcionalidad de estas proteínas ancladas a la GPI. El objetivo de este trabajo es estudiar la función molecular de PIGF en la regulación de la placentación in vitro e in vivo. Para ello, hemos generado células madre trofoblásticas de ratón (mTSC) mutantes para Pigf mediante la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 para evaluar la capacidad de autorrenovación y diferenciación de estos mutantes en comparación con los homólogos de control mediante PCR en tiempo real. Además, aprovecharemos las muestras histológicas de placentas de ratones E9.5 de tipo salvaje y Pigf mutantes disponibles en el laboratorio para realizar varios análisis de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia y validar el potencial defecto placentario y el mecanismo molecular encontrado durante los experimentos in vitro.

[EN] The placenta is a complex organ essential for nutrient and oxygen exchange between the mother and the developing fetus. Thus, the placenta arbitrates the outcomes of fetal growth and development. We have evidence that the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis pathway is of particular importance for early placental development, leading to a severe placental phenotype in knockouts that may underlie the embryonic lethality in mice. In this study we investigate the role of the GPI phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class F (Pigf) in regulating mouse placentation. Pigf gene encodes a protein involved in GPI biosynthesis, specifically in glycosylphosphatidylinositol (GPI) biosynthesis's ethanolamine phosphate (EtNP) transfer stages. PIGF forms a heterodimer with either PIGG or PIGO, two enzymes that transfer an EtNP to GPI's second and third mannoses. And without the stabilizing role of PIGF, both PIGO and PIGG would be immediately degraded without being able to exert their enzymatic activity, which is essential for the formation of GPI. This GPI serves as a docking site in the membrane for at least 150 human proteins suggesting an important role for the stability and functionality of these GPI-anchored proteins. The aim of this work is to study the molecular function of PIGF in regulating in vitro and in vivo placentation. For this purpose, we have generated knockout (KO) Pigf mouse trophoblast stem cells (mTSC) by using the CRISPR/Cas9 genome editing technology to assess the self-renewal and differentiation capacity of these mutants compared to control counterparts by Real-Time (RT)- QPCR. Moreover, we will take advantage of histological samples from wild type and Pigf KO mouse E9.5 placenta available in the lab, to perform several immunohistochemistry and immunofluorescence analysis and validate the potential placental defect and the molecular mechanism found during the in vitro experiments.