Obtención de microgeles que incorporan fibroína de seda para el cultivo celular en entornos 3D fluidos

Abstract

[ES] La fibroína, la proteína principal de la seda, ha sido durante mucho tiempo un biomaterial ampliamente utilizado por sus excelentes propiedades mecánicas o su biocompatibilidad. En el campo de la ingeniería tisular se ha empleado en diversas aplicaciones, especialmente en la regeneración ósea y vascular debido a la gran cantidad de conformaciones en las que se puede disponer. Ante la necesidad de desarrollar modelos tridimensionales biomiméticos del microambiente celular, se está planteando el uso de la fibroína de seda como soporte macroporoso de células tumorales. En esta área, se plantea el objetivo principal de este trabajo: la generación de un microgel que incorpore fibroína de seda para el desarrollo de una plataforma de cultivo apta para la proliferación de células de Mieloma Múltiple, una neoplasia hematológica que afecta a las células plasmáticas del sistema inmunitario.

Para ello, mediante microfluídica se han generado microesferas magnéticas con base de alginato en un rango estable de tamaños. Estas microesferas han sido funcionalizadas con dos biopolímeros, poli-L-Lisina y condroitín sulfato mediante la técnica Layer-by-Layer. La fibroína de seda se ha injertado sobre la superficie del recubrimiento aprovechando la química del glutaraldehído y de la carbodiimida. Se ha caracterizado la morfología de las microesferas obtenidas, así como de sus recubrimientos e injertos mediante diversas técnicas como la microscopía óptica y electrónica de barrido, espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier o termogravimetría.

La respuesta biológica al entorno tridimensional generado se ha analizado mediante cultivos de células plasmáticas tumorales de Mieloma Múltiple pertenecientes a la línea celular RPMI 8226. Los cultivos se han realizado en criotubos en medio líquido en el que se ha mantenido en suspensión tanto a las células como al microgel bajo una agitación suave. Se ha evaluado y comparado la proliferación y viabilidad celular mediante un ensayo MTS de un microgel que incorpora fibroína de seda respecto a otro que no la contenía. Con este ensayo se ha concluido que los microgeles con fibroína de seda entrecruzados con glutaraldehído no han repercutido sobre la viabilidad de las células, resultando ser biocompatibles.

En conclusión, se han conseguido los objetivos propuestos y se han desarrollado microgeles que simulan el nicho biológico del entorno de las células plasmáticas tumorales competentes para el estudio del Mieloma Múltiple.

[EN] Fibroin, the main protein in silk, has long been a widely used biomaterial due to its excellent mechanical properties or its biocompatibility. In the field of tissue engineering, it has been used in various applications, especially in bone and vascular regeneration due to the large number of conformations in which it is available. In view of the need to develop biomimetic three-dimensional models of the cellular microenvironment, the use of silk fibroin as a scaffold for tumour cells is being considered. In this area, the main objective of this project is the generation of a microgel incorporating silk fibroin in order to develop a culture platform suitable for the proliferation of Multiple Myeloma cells, a haematological neoplasm which affects the plasma cells of the immune system.

For this purpose, alginate-based magnetic microspheres have been generated using microfluidics in a stable range of sizes. These microspheres have been functionalised with two biopolymers, poly-L-lysine and chondroitin sulphate using the Layer-by-Layer technique. The silk fibroin has been grafted onto the surface of the coating by exploiting the chemistry of glutaraldehyde and carbodiimide. The morphology of the microspheres obtained, as well as their coatings and grafts, has been characterised using various techniques such as optical and scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy and thermogravimetry.

The biological response to the generated three-dimensional environment has been analysed using cultures of Multiple Myeloma tumour plasma cells belonging to the RPMI 8226 cell line. The cultures were grown in cryotubes in liquid medium in which both the cells and the microgel were kept in suspension under gentle agitation. Cell proliferation and viability were evaluated and compared by MTS assay of a microgel incorporating silk fibroin versus a microgel without silk fibroin. This assay concluded that microgels with silk fibroin cross-linked with glutaraldehyde did not affect cell viability and were biocompatible.

In conclusion, the proposed objectives have been achieved. Microgels capable of simulating the biological niche of the environment of tumour-competent plasma cells for the study of Multiple Myeloma have been developed.