Función de IDH2 en la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuroblastomas con MYCN amplificado

Abstract

[ES] El neuroblastoma (NB) es el segundo tumor sólido más común en niños en Europa y Estados Unidos, representando del 8 al 10% de los cánceres infantiles, superado solo por los tumores del sistema nervioso central. El NB se clasifica en cuatro categorías: riesgo muy bajo, riesgo bajo, riesgo intermedio y riesgo alto. Actualmente, para mejorar el pronóstico de los casos de alto riesgo, después de altas dosis de quimioterapia y radioterapia, los pacientes se tratan con el agente diferenciador ácido 13-cis-retinoico (AR) combinado con inmunoterapia. Desgraciadamente, la tasa de supervivencia a los 5 años se sigue manteniendo por debajo del 50%. Por ello, es necesario desarrollar terapias más efectivas que aumenten la supervivencia a largo plazo de los pacientes con este subtipo de NB. Numerosos estudios han demostrado la capacidad del AR de inducir la diferenciación neural en ciertas líneas de NB. Sin embargo, hay tumores que, bien por tener amplificación de MYCN, bien por tener otras alteraciones que también les confieren características de célula madre, poseen mayor resistencia a los tratamientos y, por tanto, mayor probabilidad de recaída. La identificación de los mecanismos que les confieren mayor resistencia al tratamiento podría identificar nuevas dianas terapéuticas para tratamientos más eficaces. Las mutaciones somáticas de ganancia de función en isocitrato deshidrogenasas (IDH) 1 y 2 se encuentran en múltiples tumores hematológicos y sólidos, lo que lleva a la acumulación del oncometabolito (R)-2-hidroxiglutarato (2HG). 2HG inhibe competitivamente las dioxigenasas dependientes de ¿-cetoglutarato causando una desregulación epigenética que pudiera estar implicada en el bloqueo de la diferenciación celular. AG-221 es un inhibidor potente de la enzima IDH2 mutada, que suprime la producción de 2HG e induce diferenciación tanto en células procedentes de pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA), como en blastos malignos. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado la asociación entre la sobreexpresión de MYCN y IDH2 en varias cohortes de pacientes. Nuestra hipótesis de trabajo es que la producción de 2HG debida a la sobreexpresión de IDH2, es un importante inhibidor de la diferenciación celular inducida por AR. Por tanto, el tratamiento concomitante de AR y de AG-221 podría ayudar a reprogramar el proceso de diferenciación neural, mejorar la eficacia del tratamiento y aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con NB de alto riesgo. El objetivo fundamental de este TFM es elucidar la función de la sobreexpresión de IDH2 en el proceso de diferenciación neuronal inducida por AR. Para ello, las tareas a realizar son: 1) estudiar la proliferación y supervivencia celulares (XTT) en las líneas de NB con y sin MYCN amplificado, SK-N-BE(2) y SH-SY5Y, tras inducir la diferenciación con AR, y en presencia o ausencia del inhibidor de la producción de 2HG, AG-221, 2) cuantificar el grado de diferenciación celular, tanto en morfología de neuritogénesis como en la expresión de genes específicos de neurona, en células tratadas con AR y/o con AG-221, y 3) determinar la expresión de marcadores de célula madre en ensayos de inmunofluorescencia y de inmunotransferencia en células tratadas con AR y/o con AG-221.

[EN] Neuroblastoma (NB) is the second most common solid tumor in children in Europe and the United States, accounting for 8-10% of childhood cancers, second only to central nervous system tumors. NB is classified into four categories: very low risk, low risk, intermediate risk and high risk. Currently, to improve the prognosis of high-risk cases, after high-dose of chemotherapy and radiotherapy, patients are treated with immunotherapy and the differentiating agent 13-cis-retinoic acid (RA). Unfortunately, the 5-year survival rate remains below 50%. Therefore, there is a need to develop more effective therapies in order to increase the long-term survival of patients with this subtype of NB. Many studies have shown that treatment with the optimal concentration of RA on certain NB cell lines induces neural differentiation, thus decreasing the rate of cell proliferation. However, there are tumors that, either because they have MYCN amplification or because they have other alterations that also confer stem cell characteristics, have greater resistance to treatment and, therefore, a higher probability of relapse. The identification of the mechanisms that confer them greater resistance to treatment could identify new therapeutic targets for more effective treatments. Somatic gain-of-function mutations in isocitrate dehydrogenases (IDH) 1 and 2 are found in multiple hematological and solid tumors, leading to the accumulation of the oncometabolite (R)-2-hydroxyglutarate (2HG). 2HG competitively inhibits ¿-ketoglutarate-dependent dioxygenases causing epigenetic dysregulation that may be involved in blocking cell differentiation. AG-221 is a potent inhibitor of the mutated IDH2 enzyme, was found to suppress the production of the oncometabolite 2HG and induce differentiation in cells from both acute myeloid leukemia (AML) patients and malignant blasts. Previous studies from our laboratory have demonstrated the association between MYCN and IDH2 overexpression in several patient cohorts. Our working hypothesis is that 2HG production due to IDH2 overexpression is an important inhibitor of RA-induced cell differentiation. Therefore, concomitant treatment of RA and AG-221 could help to reprogram the neural differentiation process and thus improve treatment efficacy and increase the survival rate of high-risk NB patients. The fundamental objective of this TFM is to elucidate the role of IDH2 overexpression in the RA-induced neuronal differentiation process. To this end, the tasks to be performed are: 1) to study cell proliferation and survival (XTT) in NB lines with and without amplified MYCN, SK-N-BE(2) and SH-SY5Y, after inducing differentiation with RA, and in the presence or absence of the 2HG production inhibitor, AG-221, 2) to quantify the degree of cell differentiation, both in neuritogenesis morphology and neuron-specific gene expression, in cells treated with RA and/or AG-221, and 3) determine the expression of stem cell markers in immunofluorescence and immunoblotting assays in cells treated with RA and/or AG-221.