In vitro validation of KFABP as a potential ferroptosis biomarker in cells through its induction by GPX4 knockout

Abstract

[ES] La ferroptosis es un tipo de muerte celular programada y descontrolada. Este traumático proceso es causado por una hiperperoxidación dependiente del hierro de los lípidos poliinsaturados de la membrana celular. En condiciones normales, la peroxidación de lípidos está controlada por la enzima glutatión peroxidasa 4 (GPX4), entre otros componentes presentes en el medio celular, su función principal es mantener la integridad de la membrana mediante la reducción de los radicales oxidantes. Esto presenta GPX4 como un objetivo interesante para futuros estudios ya que se ha demostrado que la supresión de su expresión causa ferroptosis. Sin embargo, aunque actualmente la ferroptosis se está estudiando en profundidad, todavía no existe un biomarcador validado para la detección de ferroptosis fuera del cultivo celular. Por lo tanto, presenta un impedimento que dificulta su detección in vivo, y así, su aplicación clínica. El principal objetivo del proyecto es caracterizar y validar KFABP como biomarcador específico de ferroptosis mediante un amplio abanico de técnicas experimentales. Esto se logrará eliminando el gen GPX4 con CRISPR-Cas9 para causar ferroptosis en tres líneas celulares diferentes. Esto se logrará suprimiendo la expresión del gen GPX4 con CRISPR-Cas9 para causar ferroptosis en tres líneas celulares diferentes y en consecuencia estudiar la presencia de KFABP en las muestras. KFABP es una proteína de unión a ácidos grasos descubierta por primera vez en queratinocitos, su expresión se detecta mediante microscopía de alto contenido y PCR cuantitativa. Además, después del KO inicial de GPX4 usando CRISPR-Cas9 para establecer la línea de base, el biomarcador hipotético se validará mediante Western Blot en líneas celulares que sobreexpresan KFABP junto con una prueba de especificidad de anticuerpos anti-KFABP para garantizar la ausencia de reacción cruzada. El estudio de la ferroptosis es muy prometedor ya que su detección permitirá la puesta en marcha de una amplia variedad de estudios que no pueden llevarse a cabo por la falta de biomarcadores. Por lo tanto, la validación de KFAPB como biomarcador para este programa específico de muerte celular puede facilitar su estudio, así como promover la implementación clínica.

[EN] Ferroptosis is a type of programmed and uncontrolled cell death. This traumatic process is caused by an iron-dependent hyper-peroxidation of polyunsaturated lipids in the cell membrane. In healthy conditions, lipid peroxidation is controlled by glutathione peroxidase 4 (GPX4), among other antioxidant components present in the cell environment, its main function is to maintain membrane integrity by reducing the oxidizing radicals. This presents GPX4 as an interesting target for further studies since it has been demonstrated that its knockout causes ferroptosis. Nevertheless, although currently ferroptosis is being studied extensively, there is still no biomarker validated for ferroptosis detection outside cell culture. Therefore, it presents an impediment that prevents its detection in vivo, hence hindering its clinical application. The main objective of the project is to characterize and validate KFABP, as a specific ferroptosis biomarker by means of a broad range of experimental techniques. This will be achieved by knocking out the GPX4 gene with CRISPR-Cas9 to cause ferroptosis in three different cell lines and consequently studying the presence of KFABP in the samples. KFABP is a fatty acid-binding protein discovered for the first time in keratinocytes. Its expression will be detected using high-content microscopy and quantitative PCR. Furthermore, following the initial GPX4 KO using CRISPR-Cas9 to set the baseline, the hypothetical biomarker is to be validated by Western Blot in KFABP overexpressing cell lines together with an anti-KFABP antibody specificity test to ensure the absence of cross-reaction. The study of ferroptosis is very promising since its detection will allow the setup of a wide variety of studies that cannot take place because of the lack of markers. Thus, the validation of KFAPB as a biomarker for this specific cell death program may facilitate its study as well as promote clinical implementation.