Real-time PCR quantification of muscular atrophy markers in the presence of sphingolipid metabolism inhibitors.

Abstract

[ES] La atrofia del músculo esquelético se caracteriza por un desgaste y disminución del tamaño de las fibras y la masa muscular y puede ser causada por distintas condiciones como la distrofia, el envejecimiento (sarcopenia) o la caquexia asociada al cáncer. La mayoría de los casos de esta atrofia van acompañados de un desequilibrio entre la síntesis y la degradación proteica al verse activadas las vías degradadoras de la célula. Solo se conoce una parte de los múltiples reguladores de esta degradación muscular, entre los cuales parece estar la familia de los esfingolípidos. La inflamación supone elevados niveles de citocinas inflamatorias, por lo que es capaz de inducir potentemente la degradación muscular y la caquexia. El factor de necrosis tumoral (TNFα) tiene un rol importante en dicha atrofia ya que es capaz de disminuir el contenido proteico, activar la proteólisis dependiente de ATP y, al ligarse a sus receptores específicos; activar múltiples vías de señalización posteriores. Una de estas vías conlleva la formación de esfingolípidos como la esfingosina, cuya posterior fosforilación por parte de las esfingosinas quinasas (SK1 y SK2) llevará a la formación de esfingosina 1-fosfato (S1P): capaz de regular procesos y funciones celulares de vital importancia a través de sus receptores específicos (S1PR1-5). En este estudio, se emplearán cultivos celulares de células C2C12 de origen murino en dos formas: mioblastos, precursores comprometidos; y miotubos, células completamente diferenciadas. La atrofia muscular causada por caquexia se inducirá en los cultivos mediante dexametasona. En los mioblastos C2C12, la S1P actúa como regulador negativo de la proliferación y la migración celular y como potente activador de la diferenciación miogénica y desencadenador de vías estrictamente relacionadas con la supervivencia celular. Los experimentos se llevarán a cabo tratando las células C2C12 con inhibidores de modificaciones postraduccionales, como son la metilación o la acetilación, directamente relacionadas con la formación de esfingosina 1-fosfato y su señalización. El objetivo de este estudio será profundizar en el rol de los esfingolípidos en la atrofia muscular y la caquexia con el fin de comprender el funcionamiento de la vía de señalización de cara a encontrar un futuro fármaco que consiga frenar esta patología. Se pretende obtener resultados en cuanto a la expresión diferencial de los niveles de RNA mensajero proveniente de genes relacionados con la manifestación de la caquexia asociada al cáncer, como serán los receptores específicos (S1PR) o las esfingosina-quinasas. Para ello, el análisis de los resultados obtenidos mediante real-time PCR deberá revelar cómo varían estos niveles en células tratadas con el tratamiento consistente en inhibidores respecto a los niveles control de C2C12 sanas y C2C12 con atrofia inducida.

[EN] Skeletal muscle atrophy is characterised by a big wasting and decrease in fibre size and muscle mass and can be caused by various conditions such as dystrophy, ageing (sarcopenia) or cancer-associated cachexia. Most cases of this atrophy involve an imbalance between protein synthesis and degradation as the cell's degradation pathways are activated. Only part of the multiple regulators of this muscle degradation is known, of which the sphingolipid family appears to be one. Inflammation involves high levels of inflammatory cytokines and is therefore capable of potently inducing muscle degradation and cachexia. Tumour necrosis factor (TNFα) plays an important role in such atrophy as it can decrease protein content, activate ATP-dependent proteolysis and, by binding to its specific receptors; activate multiple downstream signalling pathways. One of these pathways is linked to the formation of sphingolipids such as sphingosine, whose subsequent phosphorylation by sphingosine kinases (SK1 and SK2) will lead to the formation of sphingosine 1-phosphate (S1P): capable of regulating vital cellular processes and functions through its specific receptors (S1PR1-5). In this study, cell cultures of murine C2C12 cells will be used in two forms: myoblasts, committed precursors; and myotubes, fully differentiated cells. Muscle atrophy caused by cachexia will be induced in the cultures by dexamethasone. In C2C12 myoblasts, S1P acts as a negative regulator of cell proliferation and migration and as a potent activator of myogenic differentiation and trigger of pathways strictly related to cell survival. Experiments will be carried out by treating C2C12 cells with inhibitors of post-translational modifications, such as methylation or acetylation, directly related to the formation of sphingosine 1-phosphate and its signalling. The aim of this study is to investigate the role of sphingolipids in muscle atrophy and cachexia to understand how the signalling pathway works in order to find a future drug that can stop this pathology. The aim is to obtain results regarding the differential expression of messenger RNA levels from genes related to the manifestation of cancer-associated cachexia, such as specific receptors (S1PR) or sphingosine kinases. To this end, the analysis of the results obtained by real-time PCR should reveal how these levels vary in cells treated with the inhibitor treatment with respect to the control levels of healthy C2C12 and C2C12 with induced atrophy.