Tomato mottle mosaic virus: detección, transmisión y localización en semilla comercial de tomate y pimiento. Caracterización molecular de aislados

Abstract

[ES] El virus del mosaico moteado del tomate (Tomato mottle mosaic virus, ToMMV es un virus emergente que se describió por primera en 2013 en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.) de México. Posteriormente, fue detectado en cultivos de tomate y pimiento (Capsicum annuum L.) de otros países de América, Asia y Europa. ToMMV pertenece al género Tobamovirus y familia Virgaviridae. Durante muchos años, los principales tobamovirus que infectaban los cultivos de tomate y pimiento eran controlados haciendo uso de cultivares resistentes y lotes de semillas libres de virus. No obstante, la aparición de nuevos virus de este género que pueden superar la resistencia de dichos cultivares, como es el caso de ToMMV, y el hecho de que recientemente se haya demostrado la presencia de dicho virus en un elevado porcentaje de semillas que se introducen en la región de la EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization), suponen una amenaza para la industria del tomate y pimiento. A pesar de la importancia de estos cultivos en la región de la EPPO, no hay mucha información sobre ToMMV, por lo que se necesitan más estudios para determinar mejor su distribución geográfica, su epidemiología e impacto económico. Los objetivos del presente Trabajo de Fin de Grado son: analizar la presencia de ToMMV en semilla comercial de tomate y pimiento, estudiar la transmisión de semilla contaminada a plántula estableciendo además la capacidad infectiva del mismo, determinar la localización del virión en semilla de tomate, así como realizar un estudio de variabilidad entre diferentes aislados virales. Para ello, se analizan 93 lotes de semilla comercial de tomate y pimiento procedentes de países terceros e importadas por empresas españolas entre julio 2021 y enero 2022. Para conocer la localización de los viriones de ToMMV en la semilla, se pregerminan aproximadamente 120 semillas de tomate en fiambreras con papel humedecido. Tras la germinación, se analizan por separado la radícula-primordio de hojas y la cubierta seminal de las mismas. La detección de ToMMV en semilla entera, cubierta y radícula-primordio de hojas se lleva a cabo mediante la técnica molecular RT-PCR previa extracción de RNA. El estudio de transmisión de ToMMV a plántulas se lleva a cabo mediante la siembra de 250 semillas de tomate de dos lotes comerciales que previamente habían resultado positivas a ToMMV. Las plántulas se desarrollan bajo condiciones fitosanitarias controladas en un fitotrón durante 8 semanas. También se estudia la capacidad infectiva del ToMMV detectado en un lote de semilla comercial de tomate mediante la inoculan mecánica artificial de plántulas de tomate con extractos de semillas contaminados, para su análisis 4 semanas después. Para los análisis de las plantas se emplea la técnica DAS-ELISA. Para la caracterización molecular de ToMMV se seleccionan aislados de ToMMV detectados en varios lotes de semillas procedentes de China, Israel y EEUU y se comparan mediante un análisis BLAST con aislados del virus depositados en la base de datos del GenBank del NCBI.

[EN] Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) is an emerging virus that was first described in 2013 in tomato (Solanum lycopersicum L.) crops in Mexico. Later, it was detected in tomato and pepper (Capsicum annuum L.) crops in other countries of America, Asia and Europe. ToMMV belongs to the genus Tobamovirus and family Virgaviridae. For many years, the main tobamoviruses infecting tomato and pepper crops were controlled by using resistant cultivars and virus-free seed lots. However, the emergence of new viruses of this genus that can overcome the resistance of these cultivars, such as ToMMV, and the fact that ToMMV has been recently found in a high percentage of seeds imported to countries of the EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organisation) region, pose a threat to the tomato and pepper industry. Despite the importance of these crops in the EPPO region, there is not much information on ToMMV, so more studies are needed to better determine its geographical distribution, epidemiology and economic impact. The objectives of this work are: to analyze the presence of ToMMV in commercial tomato and pepper seeds, to study the transmission from contaminated seeds to seedlings and to establish the infectivity of the virus, to determine the location of the virion in tomato seeds, and to carry out a study of variability between different viral isolates. For this purpose, 93 batches of commercial tomato and pepper seed from third countries and imported by Spanish companies between July 2021 and January 2022 were analyzed. To determine the location of ToMMV virions in the seed, approximately 120 tomato seeds were pre-germinated in flasks with humid paper. After germination, the radicle-leaf primordium and the seed coat of the leaves are analyzed, separately. The detection of ToMMV in whole seed, seed coat and radicle-leaf primordium is carried out by RT-PCR technique after RNA extraction. The study of ToMMV transmission to seedlings is carried out by sowing 250 tomato seeds from two commercial lots that previously tested positive for ToMMV. Seedlings are grown under controlled phytosanitary conditions in a growing chamber for 8 weeks. The infectivity of ToMMV detected in a commercial tomato seed lot is also studied by artificially mechanically inoculating tomato seedlings with contaminated seed extracts which will be analyzed 4 weeks after inoculation. The DAS-ELISA technique was used for the analysis of the plants. For molecular characterisation of ToMMV, ToMMV isolates detected in several seed lots from China, Israel, and the USA are selected and compared by BLAST analysis with virus isolates deposited in the NCBI GenBank database.