Estudio de los transportadores de potasio AtKAT1, AtKAT2 y AtHKT1 y de la interacción de AtKAT1 con las quinasas AtOST1, AtSnRK2.2 y AtSnRK2.3 en Saccharomyces cerevisiae. Análisis del sistema Split-Trp

Abstract

[ES] AtKAT1 y AtKAT2 son dos canales de potasio de rectificación interna dependientes de voltaje que se expresan principalmente en células oclusivas de órganos aéreos de Arabidopsis thaliana. AtHKT1 es un transportador de potasio de Arabidopsis, aunque desde su caracterización inicial, su papel como transportador de potasio de alta afinidad ha sido cuestionado y actualmente se considera que es un transportador de sodio. En este trabajo se ha pretendido estudiar la funcionalidad de estos tres transportadores en Saccharomyces cerevisiae. Para ello se clonaron en los vectores pICTrp (CEN) y pICTrp (2¿), que son vectores centromérico (bajo número copias) y multicopia, respectivamente. Células de levadura mutantes que carecen de los genes que codifican por los transportadores de potasio de alta afinidad (TRK1 y TRK2) fueron transformadas con los genes AtKAT1, AtKAT2 y AtHKT1 clonados en el vector pICTrp (2¿) y se realizaron ensayos de crecimiento en medio sólido en presencia y ausencia de concentraciones tóxicas de cloruro de litio. Estos ensayos, junto con análisis Western, confirmaron que tanto AtKAT1 como AtKAT2 se expresan y son funcionales en levadura; sin embargo, no se obtuvieron evidencias de que AtHKT1 se expresa eficientemente este sistema experimental. Además, se ha estudiado la regulación de AtKAT1 por las quinasas AtOST1, AtSnRK2.2 y AtSnRK2.3. Para ello se co-transformaron dos cepas distintas de levadura, W3031A trk1, trk2 y BY4741 trk1, trk2, con el gen AtKAT1 clonado en el vector pICTrp (2¿) y con las quinasas clonadas en los vectores pGBT9 y pNTrp (2¿). A continuación se hicieron ensayos de crecimiento en medio sólido en presencia y ausencia de concentraciones tóxicas de cloruro de litio. Los resultados obtenidos fueron ligeramente distintos en las dos cepas ensayadas. No obstante, observamos que las células co-transformadas con AtOST1 y At SnRK2.2 mostraron tolerancia a cloruro de litio, aunque no está claro si esta tolerancia requiere la expresión de AtKAT1 o refleja la regulación de transportadores endógenos. Sin embargo, las células co-transformadas con AtSnRK2.3 no muestran tolerancia a litio, por lo que esta quinasa no funciona de igual manera que las otras dos estudiadas en estos ensayos. Por último, se intentó establecer un sistema experimental para analizar posibles interacciones físicas entre AtKAT1 y su reguladora, la quinasa AtOST1 (y AtSnRk2.2 y AtSnRK2.3). Concretamente, se analizó el funcionamiento del sistema de detección de interacciones proteína-proteína Split-Trp. Para ello, se co-transformaron células de levadura W303-1A con pICTrp (2¿)-AtKAT1 y con AtOST1, AtSnRK2.2 y AtSnRK2.3 clonados en pNTrp (2¿) y se realizó un ensayo de crecimiento en medio sólido en ausencia de triptófano. No se obtuvieron resultados positivos, de manera que este sistema no ha sido útil para estudiar la posible interacción física directa entre AtKAT1 y las quinasas.

[EN] AtKAT2 and AtKAT1 are two voltage-dependent, inward rectifying potassium channels mainly expressed in guard cells of aerial organs of Arabidopsis thaliana. AtHKT1 is a potassium transporter from Arabidopsis, although since its initial characterization, its role as a high affinity potassium transporter has been questioned and is now considered to transport sodium. This project aimed to explore the functionality of these three transporters in Saccharomyces cerevisiae. These three Arabidopsis orfs were cloned into the vectors pICTrp (CEN) and pICTrp (2¿), which are centromeric (low copy) and multicopy vectors, respectively. Mutant yeast cells lacking the two main potassium transport genes (TRK1 and TRK2) were transformed with AtKAT1, AtKAT2 and AtHKT1 cloned into the pICTrp (2¿) vector and growth assays were performed on solid medium in the presence and absence of toxic concentrations of lithium chloride. These growth tests and subsequent Western anaylses confirmed that both AtKAT1 as AtKAT2 are expressed in yeast and are functional, but no evidence was obtained that AtHKT1 functions in this model system. Additionally, we studied the regulation of AtKAT1 by the protein kinases AtOST1, AtSnRK2.3 and AtSnRK2.2. The pICTrp (2¿)-AtKAT1 plasmid was co-transformed with different kinase-containing pNTrp and pGBT9 plasmids in two different yeast strains: W3031A trk1, trk2 and BY4741 trk1, trk2. Growth tests were performed on solid media with and without toxic concentrations of lithium chloride. The results were slightly different in the two strains tested. However, we observed that cells co-transformed with AtOST1 and AtSnRK2.2 conferred tolerance lithium chloride, although it is unclear if this tolerance phenotype requires the expression of AtKAT1 or if it reflects the regulation endogenous yeast transporters. On the other hand, cells co-transformed with AtSnRK2.3 did not display lithium tolerance, indicating that this kinase does not perform the same function in these assays. Finally, we attempted to establish an experimental system to study the possible physical interaction between AtKAT1 and its known regulator, AtOST1 (and AtSnRK2.2 and AtSnRK2.3). To do this, we used the Split-Trp protein-protein interaction detection system to try to evaluate possible interactions between the AtKAT1 potassium transporter and the three kinase genes. For this, W3031A yeast cells were co-transformed with pICTrp (2¿)-AtKAT1 and AtOST1, AtSnRK2.2 and AtSnRK2.3, cloned into pNTrp (2¿). Protein-protein interaction tests were conducted on solid growth medium lacking tryptophan. No positive results were obtained, so we conclude that this system is not useful to study the whether a direct physical interaction exists between the kinases and AtKAT1.