Expresión de pequeños RNAs artificiales en Nicotiana benthamiana mediante el virus del arrugamiento de la hoja de la col

Abstract

[ES] El silenciamiento génico o RNA de interferencia (RNAi) ha sido descrito como un medio para suprimir la actividad de un gen tanto en plantas como en animales, y está basado en pequeños RNAs (sRNAs) de 20-35 nucleótidos (nt) no codificantes que se unen por complementariedad de secuencia a moléculas de RNA específicas dando lugar a su degradación. Este sistema ha demostrado ser una herramienta eficaz para modificar o mejorar los rasgos moleculares, bioquímicos, fisiológicos y agronómicos de las plantas. La especificidad limitada de los enfoques clásicos de RNAi fue superada por el desarrollo reciente de estrategias de segunda generación basadas en sRNAs artificiales (art-sRNAs) como los microRNAs artificiales (amiRNAs) y los tasiRNAs sintéticos (syn-tasiRNAs). Actualmente el uso de art-sRNAs en plantas se basa en la expresión de precursores de art-sRNAs en plantas transgénicas, lo que limita su aplicación en cultivos e insta a encontrar alternativas no transgénicas para su expresión. En este Trabajo Fin de Máster se ha explorado la posibilidad de expresar amiRNAs y syn-tasiRNAs en plantas de una manera no transgénica, empleando el virus del arrugamiento de la hoja de la col (CaLCuV, Cabbage leaf curl virus) como vector viral para silenciar el gen SULPHUR de Nicotiana benthamiana (NbSu) e inducir el amarilleamiento del tejido silenciado. Con este objetivo, se generaron una serie de construcciones para expresar por agroinoculación en N. benthamiana precursores completos o acortados tanto de amiRNAs como de syn-tasiRNAs a partir de CaLCuV y silenciar el gen NbSu. Diversos análisis moleculares y fenotípicos realizados en hojas apicales de las plantas agroinoculadas con las distintas construcciones indican que es posible expresar ambos tipos de art-sRNAs en tejidos infectados por CaLCuV. Estos resultados abren camino a futuras nuevas herramientas no transgénicas y basadas en virus de plantas para la manipulación de la expresión génica en plantas mediante art-sRNAs.

[EN] Gene silencing or RNA interference (RNAi) has been described as a means of suppressing gene activity in both plants and animals, and is based on small non-coding RNAs (sRNAs) of 20-35 nucleotides (nt) that bind by sequence complementarity to specific RNA molecules, leading to their degradation. This system has proven to be an effective tool to modify or improve the molecular, biochemical, physiological and agronomic traits of plants. The limited specificity of classical RNAi approaches was overcome by the recent development of second-generation strategies based on artificial sRNAs (art-sRNAs) such as artificial microRNAs (amiRNAs) and synthetic tasiRNAs (syn-tasiRNAs). Currently, the use of art-sRNAs in plants is based on the expression of art-sRNAs precursors in transgenic plants, which limits their application in crops and encourages finding non-transgenic alternatives for their expression. In this Master's Thesis, the possibility of expressing amiRNAs and syn-tasiRNAs in plants in a non-transgenic way has been explored, using the Cabbage leaf curl virus (CaLCuV) as a viral vector to silence the SULPHUR gene from Nicotiana benthamiana (NbSu) and induce yellowing of the silenced tissue. With this objective, a series of constructs were generated to express by agroinoculation in N. benthamiana complete or shortened precursors of both amiRNAs and syn-tasiRNAs from CaLCuV and to silence the NbSu gene. Various molecular and phenotypic analyses performed on apical leaves of plants agroinoculated with the different constructs indicate that it is possible to express both types of art-sRNAs in tissues infected by CaLCuV. These results open the way to future new non-transgenic and plant virus-based tools for the manipulation of gene expression in plants using art-sRNAs.