Construcción de una planta hepática con capacidad de percibir giberelinas

Abstract

[ES] Las giberelinas (GAs) regulan múltiples procesos a lo largo de la vida de las plantas vasculares (floración, crecimiento de los órganos, producción de madera). La ruta de señalización de GAs consiste en la percepción de la hormona por parte de un receptor (GID1) que entonces es capaz de interaccionar físicamente con las proteínas DELLA a través de su domino N-terminal, provocando su degradación por el proteasoma. Estas proteínas son reguladores transcripciones que interaccionan con factores de transcripción a través de su dominio C-terminal (o dominio GRAS). Los musgos y las hepáticas son especies vegetales que carecen de receptor de GAs, pero sí que conservan proteínas DELLA con función equivalente a las de plantas vasculares. ¿Qué le pasará a las plantas de estas especies si les introducimos la capacidad de percibir giberelinas y responder a ellas? El objetivo general de este trabajo es introducir en la especie Marchantia polymorpha un receptor de GAs capaz de iniciar toda la cascada de señalización para

eventualmente comparar su comportamiento en competición con la versión silvestre de dicha especie. Para ello se proponen los siguientes objetivos y tareas: Objetivo 1: Construir una proteína DELLA quimérica capaz de actuar en M. polymorpha y de interaccionar con un receptor de GAs. Se fusionará el N-terminal de la proteína GAI de A. thaliana (AtGAI-N) con el dominio GRAS de MpDELLA mediante linkers de varios tamaños, y se evaluará mediante ensayos de doble híbrido en levadura la capacidad de interacción con AtGID1 exclusivamente en presencia de GAs. Se seleccionará la quimera que presente mejor comportamiento (AtGAI-N:MpDELLA-GRAS). Objetivo 2: Introducir la quimera, fusionada a GFP, en M. polymorpha. La construcción AtGAI.N:MpDELLA-GRAS:GFP bajo el control del promotor constitutivo EF1a se transformará en la variedad Tak-1 silvestre de M. polymorpha y se comprobará su funcionalidad evaluando diversos aspectos del fenotipo. Ya se sabe que la sobreexpresión de MpDELLA reduce el crecimiento y activa la expresión de genes de síntesis de flavonoides. Es de esperar que la proteína quimérica funcione de la misma manera. Objetivo 3: Introducir AtGID1 en M. polymorpha. El gen se expresará bajo el control de un promotor constitutivo en una línea silvestre (para evaluar posibles efectos secundarios de la expresión de este gen) y en una línea AtGAI-N:MpDELLA-GRAS:GFP. En esta línea se evaluará la capacidad de las GAs de (i) inducir la degradación proteolítica de la DELLA quimérica (comprobando los niveles mediante Western blot con anti-GFP); y (ii) rescatar el fenotipo de enanismo causado por la sobreexpresión de la proteína quimérica.

[EN] Gibberellins (GAs) regulate multiple processes throughout the life of vascular plants (flowering, organ growth, wood production). The GAs signaling pathway consists of the perception of the hormone by a receptor (GID1) which is then capable of physically interacting with the DELLA proteins through its N-terminal domain, causing its degradation by the proteasome. These proteins are transcription regulators that interact with transcription factors through their C-terminal domain (or GRAS domain). Mosses and liverworts are plant species that lack the GAs receptor, but do retain DELLA proteins with functions equivalent to those of vascular plants. What will happen to the plants of these species if we introduce the ability to sense gibberellins and respond to them? The general objective of this work is to introduce into the species Marchantia polymorpha a GAs receptor capable of initiating the entire signaling cascade for

eventually compare their behavior in competition with the wild version of that species. To this end, the following objectives and tasks are proposed: Objective 1: Build a chimeric DELLA protein capable of acting in M. polymorpha and interacting with a GAs receptor. The N-terminal of the GAI protein from A. thaliana (AtGAI-N) will be fused with the GRAS domain of MpDELLA using linkers of various sizes, and the ability to interact with AtGID1 exclusively in the presence of Of gas. The chimera with the best behavior (AtGAI-N:MpDELLA-GRAS) will be selected. Objective 2: Introduce the chimera, fused to GFP, into M. polymorpha. The AtGAI.N:MpDELLA-GRAS:GFP construct under the control of the constitutive EF1a promoter will be transformed into the M. polymorpha wild type Tak-1 and its functionality will be checked by evaluating various aspects of the phenotype. It is already known that overexpression of MpDELLA reduces growth and activates the expression of flavonoid synthesis genes. It is to be expected that the chimeric protein will work in the same way. Objective 3: Introduce AtGID1 into M. polymorpha. The gene will be expressed under the control of a constitutive promoter in a wild type line (to assess possible side effects of the expression of this gene) and in an AtGAI-N:MpDELLA-GRAS:GFP line. In this line, the capacity of the GAs to (i) induce the proteolytic degradation of the chimeric DELLA will be evaluated (checking the levels by Western blot with anti-GFP); and (ii) rescuing the dwarfing phenotype caused by overexpression of the chimeric protein.