Análisis histológico y transcriptómico de lesiones corticales de pacientes con esclerosis múltiple

Abstract

[ES] La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica y autoinmune del sistema nervioso central (SNC) que afecta a más de 2 millones de personas en el mundo, y que presenta tres formas clínicas principales: la esclerosis múltiple remitente recurrente (EMRR), la esclerosis múltiple primaria progresiva (EMPP) y la secundaria progresiva (EMSP). El sello patológico de la enfermedad son las lesiones focales desmielinizantes en sustancia blanca, por lo que la mayoría de los estudios hasta la fecha han enfocado sus investigaciones en estas lesiones. No obstante, la afectación cortical ha demostrado tener una estrecha relación con determinados factores de progresión en estos pacientes, como el deterioro cognitivo o la discapacidad. Los mecanismos intrínsecos a la formación de lesiones corticales son parcialmente conocidos hasta la fecha, por lo que se necesita conocer más sobre el perfil transcriptómico de estas. Las tecnologías de transcriptómica espacial permiten la visualización de patrones de moléculas de ARNm en regiones de tejido de interés proporcionando una localización bidimensional de los transcritos en el tejido. Los objetivos de este trabajo fueron la localización y caracterización de las lesiones corticales de pacientes con EM y el posterior estudio de la expresión génica espacial en dichas lesiones utilizando la tecnología Visium. En este trabajo se analizaron las lesiones presentes en 6 muestras de 3 pacientes con EMRR, EMSP y EMPP y 2 controles. Se llevaron a cabo dos pasos iniciales de caracterización de las lesiones y optimización del tiempo de permeabilización del tejido para detectar la máxima señal de ARNm; las lesiones encontradas se clasificaron en lesiones crónicas inactivas (n=4) y lesión activa (n=1) y el tiempo óptimo de permeabilización se estableció en 24 minutos. El desarrollo del protocolo de expresión génica espacial Visium constó de diferentes pasos de adherencia del tejido al portaobjetos, liberación del ARNm, captura local por sondas codificadas espacialmente, retrotranscripción, amplificación del ADNc generado, construcción de la librería y secuenciación. Empleando el software Loupe Browser, se analizaron los niveles de expresión de los genes que codificaban las proteínas estudiadas previamente a nivel histológico (PLP1, CD68 y CD3D) y marcadores genéticos específicos de tipos celulares del SNC (MAP2, CNP y GFAP). Posteriormente, un segundo análisis de expresión génica diferencial nos permitió elucidar la diversidad celular presente en el centro de la lesión activa. Los resultados del estudio de transcriptómica espacial mostraron una correlación con las diferencias observadas a nivel inmunohistoquímico. El centro de la lesión activa estuvo formado en su mayoría por astrocitos, siendo el gen GFAP el más sobreexpresado (p<0.001), seguido del gen B3GAT2 (p<0.001) y del gen AQP4 (p<0.001), además de hallar otros genes expresados en oligodendrocitos, microglía y neuronas. En conclusión, el empleo de la transcriptómica espacial ha permitido el mapeo de los principales tipos celulares presentes en lesiones de córtex cerebral de pacientes con EM. La sobreexpresión de los genes GFAP, AQP4, S100B y GJA1 ha permitido establecer una firma genética que señala a los astrocitos reactivos como las células dominantes en el centro de la lesión activa.

[EN] Multiple sclerosis (MS) is a chronic, autoimmune disease of the central nervous system affecting more than 2 million people worldwide, with three main clinical forms: relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS), primary progressive multiple sclerosis (PPMS) and secondary progressive multiple sclerosis (SPMS). The pathological hallmark of the disease is focal demyelinating lesions in the white matter, and most studies in recent decades have focused their investigations on these lesions. However, cortical involvement has been shown to be closely related to certain progression factors in these patients, such as cognitive impairment or disability. The mechanisms intrinsic to the formation of cortical lesions are only partially understood to date, so more needs to be known about the transcriptomic profile of these regions. Spatial transcriptomics technologies allow the visualisation of mRNA molecule patterns in tissue regions of interest by providing a two-dimensional localisation of transcripts in tissue. The objectives of this work were the localisation and characterisation of cortical lesions in MS patients and the subsequent study of spatial gene expression in these lesions using Visium technology. In this work, lesions present in 6 samples from 3 patients with RRMS, PPMS and PPMS and 2 controls were analysed. Two initial steps of lesion characterisation and optimisation of tissue permeabilization time were performed to detect maximal mRNA signal; the lesions found were classified into chronic inactive lesions (n=4) and active lesion (n=1) and the optimal permeabilization time was set at 24 minutes. The development of the Visium spatial gene expression protocol consisted of different steps of tissue attachment to the slide, mRNA release, local capture by spatially encoded probes, retrotranscription, amplification of the generated cDNA, library construction and sequencing. Using the Loupe Browser software, the expression levels of genes encoding proteins previously studied at the histological level (PLP1, CD68 and CD3D) and CNS cell type-specific gene markers (MAP2, CNP and GFAP) were analysed. A second differential gene expression analysis then allowed us to elucidate the cellular diversity present in the centre of the active lesion. The results of the spatial transcriptomics study correlated with the differences observed at the immunohistochemical level. The centre of the active lesion consisted mostly of astrocytes, with the GFAP gene being the most overexpressed (p<0,001), followed by the B3GAT2 gene (p<0,001) and the AQP4 gene (p<0,001), in addition to other genes expressed in oligodendrocytes, microglia and neurons. In conclusion, the use of spatial transcriptomics has allowed the mapping of the main cell types present in cerebral cortex lesions of MS patients. Overexpression of GFAP, AQP4, S100B and GJA1 genes has allowed the establishment of a genetic signature that points to reactive astrocytes as the dominant cells in the zone of increased activity of the active lesion.