Caracterización molecular de modelos celulares de déficit de Alfa-1 antitripsina

Abstract

[ES] El déficit de Alfa-1 antitripsina (DAAT) es una enfermedad respiratoria rara e infradiagnosticada caracterizada por bajos niveles circulantes de la proteína alfa-1 antitripsina (AAT), un inhibidor de serín proteasas secretada principalmente por los hepatocitos. Existen dos mutaciones predominantes en el gen SERPINA1 que causan esta enfermedad, la mutación S y la mutación Z, mientras que el alelo sano se denomina M. Estas dos mutaciones se caracterizan por provocar en algunos pacientes daños tanto a nivel respiratorio como a nivel hepático. Uno de los principales problemas que nos encontramos al trabajar con enfermedades raras respiratorias es la inexistencia, en muchos casos, de modelos de enfermedad que permitan establecer líneas de investigación dirigidas a mejorar el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de terapias. Con el objetivo de resolver esta problemática, en nuestro grupo de investigación se han desarrollado líneas celulares de linfocitos B inmortalizados derivados de pacientes con DAAT: una como control con genotipo MM y tres deficitarias con genotipos MS, MZ y SS. El objetivo de este estudio es la caracterización a nivel molecular de estas líneas celulares y de la línea celular HEK293 en la que se introdujo un plásmido con la mutación Z, con el fin de testar la validez de estas líneas celulares como modelos de esta enfermedad. Para esto, se han genotipado las líneas celulares y se han establecido sus curvas de crecimiento para describir el efecto de las variantes alélicas de SERPINA1 en el crecimiento y viabilidad celular. Seguidamente, se ha analizado la expresión de AAT a nivel de ARN mensajero mediante RT-qPCR y a nivel de proteína mediante Western Blot en condiciones desnaturalizantes. Asimismo, se ha determinado la capacidad secretora de monómeros y polímeros de AAT en las distintas líneas celulares. Los resultados obtenidos han validado estos modelos y las diferencias entre ellos, pues aparte de desarrollar un crecimiento controlado que permite su mantenimiento, presentan las características fenotípicas esperadas según su genotipo: sintetizar y secretar AAT al medio, y secretar polímeros de AAT a un determinado nivel. Finalmente, este trabajo se relaciona con el siguiente Objetivo de Desarrollo Sostenible (ODS) de la Agenda 2030: "Garantizar una vida sana y promover el bienestar a todas las edades".

[EN] Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare and underdiagnosed respiratory disease characterized by low circulating levels of the protein alpha-1 antitrypsin (AAT), an inhibitor of serine proteases secreted mainly by hepatocytes. There are two predominant mutations in the SERPINA1 gene that cause this disease, the S mutation and the Z mutation, while the healthy allele is called M. These two mutations are characterized by respiratory and hepatic damage in some patients. One of the main problems we encounter when working with rare respiratory diseases is the lack, in many cases, of disease models that allow us to establish lines of research aimed at improving knowledge of the pathophysiology of the disease and the development of therapies. In order to solve this problem, our research group has developed cell lines of immortalized B lymphocytes derived from patients with AATD: one as control with MM genotype and three deficient with MS, MZ and SS genotypes. The aim of this study is the molecular characterization of these cell lines and of the HEK293 cell line in which a plasmid with the Z mutation was introduced, in order to test the validity of these cell lines as models of this disease. For this purpose, the cell lines were genotyped and their growth curves were established to describe the effect of the allelic variants of SERPINA1 on cell growth and viability. Subsequently, AAT expression was analyzed at the messenger RNA level by RT-qPCR and at the protein level by Western Blot under denaturing conditions. The secretory capacity of AAT monomers and polymers in the different cell lines was also determined. The results obtained have validated these models and the differences between them, since apart from developing a controlled growth that allows their maintenance, they present the phenotypic characteristics expected according to their genotype: synthesize and secrete AAT to the medium, and secrete AAT polymers at a certain level. Finally, this work relates to the next Sustainable Development Goal (SDG) of the 2030 Agenda: "Ensure healthy lives and promote well-being at all ages".