Modelización in vitro de linfocitos T CD8 exhaustos humanos para el estudio del metabolismo energético

Abstract

[ES] Los linfocitos desempeñan un papel crucial en el sistema inmunológico al ser responsables de reconocer y destruir células tumorales y patógenos invasores, contribuyendo así a la supresión y control de la enfermedad. Sin embargo, en algunos casos, los linfocitos no logran ejercer su función de manera efectiva debido a la disfunción que experimentan, lo que limita su capacidad para combatir el tumor o eliminar las infecciones de manera adecuada. La aparición de este subconjunto de linfocitos exhaustos está asociada con diversos factores, como la exposición crónica a antígenos, la presencia de microambientes tumorales inmunosupresores y las señales inhibidoras persistentes. La acumulación de linfocitos exhaustos en el microambiente tumoral se ha relacionado con una respuesta inmune ineficiente y la evasión de las células tumorales al sistema inmunitario. Por esta razón, el estudio de los linfocitos exhaustos es de gran interés en el ámbito de la inmunoterapia, ya que entender sus mecanismos moleculares y vías de señalización puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas para revertir su disfunción y mejorar la respuesta inmune contra el cáncer. El objetivo de este estudio es generar linfocitos exhaustos humanos con el fin de caracterizarlos y estudiar su metabolismo energético para obtener una comprensión más profunda de los procesos involucrados en su disfunción. Con el propósito de alcanzar este objetivo, se recrea una infección crónica in vitro estimulando continuamente los correceptores del TCR para generar linfocitos exhaustos que exhiben similitudes transcripcionales y metabólicas con los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) exhaustos. La caracterización de los linfocitos exhaustos implicó, en primer lugar, el análisis de los niveles de receptores inhibidores mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa (qPCR). Con el fin de evaluar la expresión de genes centrales en el metabolismo energético, así como el consumo de ATP a nivel de glucólisis y mitocondrias, se estudió el estado de las vías energéticas mediante qPCR y un ensayo que permite medir el metabolismo celular, como el analizador Seahorse. Para complementar el análisis, se realizó un estudio del perfil lipidómico mediante espectrometría de masas para identificar posibles alteraciones lipídicas asociadas al agotamiento de los linfocitos y a su vez, se examinó la concentración de metabolitos energéticos en el medio de cultivo utilizando una cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (UPLC-MS). En este trabajo se ha observado como la estimulación crónica in vitro conduce a la generación de linfocitos exhaustos, ofreciendo un modelo in vitro preciso para simular las condiciones clínicas. En cuanto al agotamiento de estos linfocitos se ha confirmado que se caracteriza por un aumento significativo en la expresión de los receptores inhibidores PD-1, TIM-3, LAG-3 y CTLA-4. Por otra parte, se ha demostrado que experimentan una reprogramación metabólica, con disfunción mitocondrial y disminución en la oxidación de ácidos grasos y fosforilación oxidativa, compensada por un incremento en la actividad de la glucólisis. Por último, la evaluación lipidómica ha revelado una firma lipídica asociada al agotamiento, caracterizada por un aumento en los niveles de triglicéridos y ceramidas. Estos hallazgos son relevantes para desarrollar terapias inmunológicas más efectivas. Este trabajo está alineado con los ODS 3, 9 y 17, promoviendo la salud, la innovación y la colaboración global.

[EN] Lymphocytes play a crucial role in the immune system as they are responsible for recognizing and destroying tumor cells and invading pathogens, thereby contributing to disease suppression and control. However, in some cases, lymphocytes fail to effectively perform their function due to the dysfunction they experience, limiting their ability to combat tumors or adequately eliminate infections. The emergence of this subset of exhausted lymphocytes is associated with various factors such as chronic antigen exposure, the presence of immunosuppressive tumor microenvironments, and persistent inhibitory signals. The accumulation of exhausted lymphocytes in the tumor microenvironment has been linked to an inefficient immune response and evasion of tumor cells from the immune system. For this reason, the study of exhausted lymphocytes is of great interest in the field of immunotherapy, as understanding their molecular mechanisms and signaling pathways can lead to the development of therapeutic strategies to reverse their dysfunction and enhance the immune response against cancer. The aim of this study is to generate exhausted human lymphocytes in order to characterize them and study their energy metabolism to gain a deeper understanding of the processes involved in their dysfunction. To achieve this goal, a chronic in vitro infection is recreated by continuously stimulating the TCR co-receptors to generate exhausted lymphocytes that exhibit transcriptional and metabolic similarities with exhausted tumor-infiltrating lymphocytes (TILs). Characterization of exhausted lymphocytes first involved the analysis of the levels of inhibitory receptors using flow cytometry and quantitative PCR (qPCR). To assess the expression of key genes in energy metabolism, as well as ATP consumption in glycolysis and mitochondria, the state of energy pathways was studied using qPCR and an assay that allows measurement of cellular metabolism, such as the Seahorse analyzer. To complement the analysis, a study of the lipidomic profile was conducted using mass spectrometry to identify potential lipid alterations associated with lymphocyte exhaustion. Additionally, the concentration of energy metabolites in the culture medium was examined using ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS). In this study, it has been observed that chronic in vitro stimulation leads to the generation of exhausted lymphocytes, providing a precise in vitro model to simulate clinical conditions. Regarding the exhaustion of these lymphocytes, it has been confirmed that it is characterized by a significant increase in the expression of inhibitory receptors PD-1, TIM-3, LAG-3, and CTLA-4. Furthermore, it has been demonstrated that exhausted lymphocytes undergo metabolic reprogramming, with mitochondrial dysfunction and decreased fatty acid oxidation and oxidative phosphorylation, compensated by an increase in glycolysis activity. Lastly, lipidomic evaluation has revealed a lipid signature associated with exhaustion, characterized by elevated levels of triglycerides and ceramides. These findings are relevant for the development of more effective immunotherapies. This work aligns with SDGs 3, 9, and 17, promoting health, innovation, and global collaboration.