Eficiencia de un medio vitrificación con ficoll y trealosa sobre la viabilidad de embriones de conejo

Abstract

[ES] Una de las limitaciones de la crioconservación embrionaria es el hecho de que embriones de una misma especie muestran diferente criotolerancia dependiendo de cuál sea su estadio de desarrollo. En la mayor parte de las especies en las que se utilizan las técnicas de crioconservación se ha observado que el ratio de supervivencia de embriones desde el estadio pronuclear al de 8-16 células es menor al alcanzado en estadios mórula compacta o blastocisto. Estos estadios, al igual que los óvulos, muestran una gran sensibilidad al enfriamiento y a los crioprotectores por lo que a partir de los procedimientos clásicos de congelación se han desarrollado protocolos de vitrificación que incrementan la velocidad de enfriamiento. Este estudio pretende definir un medio de baja toxicidad, basado en dimetilsulfóxido (DMSO), etanol (EtOH), ficoll y trehalosa, que consiga mejorar la viabilidad de estos estadios tras la vitrificación, evaluando la viabilidad de 3 estadios embrionarios diferentes de alcanzar el desarrollo a blastocisto. Por ello se diseñaron dos ensayos de viabilidad embrionaria in vitro, el primero para comprobar la toxicidad del medio y el segundo para evaluar la respuesta al proceso de vitrificación-desvitrificación. Los embriones fueron obtenidos de hembras sometidas a un tratamiento de superovulación con coriofolitropina alfa, administrada en una única dosis de 0,5ml 72 horas antes de la inseminación. Tras esta se obtuvieron los embriones en 3 estadios: 2 células a las 24 horas, 8-16 células a las 48 horas y mórulas a las 72 horas tras la inseminación. Los ensayos de toxicidad y viabilidad post-vitrificación se llevaron a cabo con dos medios distintos: el medio OLD a base de DMSO y EtOH; (20%+20% v/v); y el medio NEW a base de 12% (v/v) DMSO, 20% (v/v) EtOH, 17% (p/v) Ficoll y 0,5M de trehalosa, empleando como soporte para la vitrificación el Cryotop. Tras la exposición a los medios y tras la desvitrificación se evaluó la capacidad de desarrollo hasta el estadio de blastocistos, a las 72 horas los de 2 células, a las 48 horas los de 8-16 células y a las 24 horas las mórulas. El estudio de toxicidad demostró que la viabilidad del medio NEW fue similar a la del medio OLD empleado actualmente en la vitrificación (en torno al 80% de desarrollo a blastocisto) y que el estadio embrionario de 2 células era el más afectado reduciendo su tasa de desarrollo a blastocisto hasta el 68% cuando eran expuestos al medio OLD. Post-desvitrificación, el medio NEW mejora la supervivencia de los embriones vitrificados, sobre todo los embriones de estadios tempranos (24 y 48 horas), alcanzando hasta un 37% de tasa de desarrollo a blastocisto en embriones de 2 células frente a tan solo un 10% con el medio OLD. Esta mejora en la viabilidad in vitro de los estadios embrionarios tempranos debe ser corroborada in vivo tras su transferencia a conejas receptoras. Este trabajo contribuye a 2 de los objetivos de desarrollo sostenible (ODS): ODS 3, salud y bienestar y ODS 15, vida de ecosistemas terrestres. El desarrollo o la puesta a punto de herramientas de biotecnología reproductiva como la crioconservación ayuda a solventar los problemas reproductivos y la planificación familiar, por otro lado, esta tecnología facilita la conservación de recursos genéticos y con ello la preservación de la biodiversidad animal.

[EN] One of the limitations of the cryopreservation of embryos is the fact that embryos of the same species demonstrate different tolerance to the cryopreservation depending on their state of development. In the majority of species where cryopreservation techniques are used, it has been observed that the survival rate of embryos from pronuclear to 8-16 cells is less than the survival seen in the states of compact morulae or blastocyst. These states, like that of the oocytes, show a significant sensibility to cooling and to the cryoprotectors, so starting from the classic freezing procedure new protocols of vitrification have been developed that increase the speed of freezing. This project intends to define a medium of low toxicity, based on dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol (EtOH), ficoll and trehalose, that succeeds in increasing the viability of these states after the vitrification, evaluating the viability of the 3 different embryonic states from initial development to blastocyst. This is why two in vitro embryo viability experiments were designed, the first to determine the toxicity of the medium and the second to evaluate the response of the process of vitrification-devitrification. The embryos were obtained from females exposed to a superovulation treatment with coriofollitropin alpha, administered in a single dose of 0,5ml 72 hours before insemination. After this, the embryos were obtained in 3 states, 2 cells at 24 hours, 8-16 cells at 48 hours and morulae at 72 hours after insemination. The toxicity and viability experiments were executed in two different mediums: the OLD medium based on DMSO and EtOH (20%+20% v/v); and the NEW medium based on 12% (v/v) DMSO, 20% (v/v) EtOH, 17% (p/v) Ficoll and 0,5M of trehalose, using Cryotop as support for the vitrification. After the devitrification, the capability of development was observed until blastocyst, at 72 hours those with 2 cells, at 48 hours those with 8-16 cells and at 24 hours the morulae. The toxicity experiment demonstrated that the viability of the NEW medium was similar to that of the OLD medium commonly used in vitrification (approximately 80% of development to blastocyst) and that the 2-cell embryo was the most affected reducing the development rates to 68% when they were exposed to the OLD medium. Post-devitrification, the NEW medium improved the survival rate of the vitrified embryos in all the early stages embryos (24 and 48 hours), reaching a 37% development ratio in the 2-cell opposed to the 10% achieved with the OLD medium. This improvement of in vitro for the 2 early embrionic stages needs to be corroborated in vivo after the transference to female receptors. This Project contributes to 2 of the objectives of sustainable development, ODS3, health and welfare and ODS 15, life of terrestrial ecosystems. The development or maintenance of biotechnology tools such as the cryoconservation, help solve reproductive problems and assist in family planning, on the other hand, this technology can also facilitate the preservation of genetic resources, leading to the preservation of animal biodiversity.