Modificación del genoma del virus del mosaico de la alfalfa (AMV) para su uso en estudios de interacción planta-virus

Abstract

[ES] El virus del mosaico de la alfalfa (AMV) se transmite a través de polen, semillas y pulgones e infecta a cultivos de interés agronómico tales como la alfalfa, el tomate o la patata. Este virus pertenece a la familia Bromoviridae y presenta un genoma consistente en tres moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de cadena sencilla y de polaridad positiva. Los ARNs 1 y 2 codifican las subunidades de la replicasa viral (P1 y P2, respectivamente). El ARN 3 codifica la proteína de movimiento (MP) y además sirve como molde para la síntesis de un ARN subgenómico (sgARN 4) del que se traduce la proteína de cubierta (CP). Actualmente se dispone de diferentes tipos de plásmidos que contienen clonado el genoma completo del AMV. De este modo, mediante metodologías como la agroinfiltración o la inoculación mecánica de trascritos de ARN se pueden establecer infecciones virales en diferentes huéspedes. Para poder infectar una planta, las proteínas virales deben interaccionar con diferentes componentes del huésped de modo que subvierten su función en favor del patógeno. Por ello, es importante la identificación de dichos factores. Por otro lado, el uso marcadores fluorescentes permite, entre otros, la obtención de imágenes la de estructuras celulares. En este trabajo se pretende abordar: i) la construcción de un plásmido que contenga el ARN 2 modificado, de modo que, la proteína P2 presente en su extremo Ct, el péptido correspondiente al epítopo de la hemaglutinina (HA) tanto individualmente como por duplicado; y ii) la generación, mediante la duplicación de la región que constituye el promotor de la síntesis del sgARN 4, de plásmidos conteniendo el ARN 3 modificado de modo que permitan la expresión de la MP, la CP y una proteína fluorescente (GFP y RFP del inglés ¿Green Fluorescent Protein¿ y ¿Red Fluorescent Protein¿, respectivamente). Estas herramientas moleculares permitirán: i) abordar estudios de co-inmunoprecipitación (Co-IP) con el fin de identificar factores celulares que interaccionen con la subunidad P2 de la replicasa viral, y ii) la visualización directa y no invasiva del proceso de infección viral.

[EN] Alfalfa mosaic virus (AMV) is transmitted through pollen, seeds and aphids and infects crops of agronomic interest such as alfalfa, tomato or potato. This virus belongs to the Bromoviridae family and presents a genome consisting of three single-stranded ribonucleic acid (RNA) molecules of positive polarity. RNAs 1 and 2 encode the viral replicase subunits (P1 and P2, respectively). RNA 3 encodes the movement protein (MP) and also serves as a template for the synthesis of a subgenomic RNA (sgRNA 4) from which the coat protein (CP) is translated. Most recently, it has been cloned the complete AMV genome into different types of plasmids. Thus, using methodologies such as agroinfiltration or mechanical inoculation of RNA transcripts, viral infections can be established in different hosts. In order to infect a plant, viral proteins must interact with different components of the host in such a way that they subvert their function in favor of the pathogen. Therefore, it is important to identify these factors. On the other hand, the use of fluorescent markers allows, among other things, obtaining images of cell structures. This work intends to address: i) the construction of a plasmid that contains the modified RNA 2, so that, the P2 protein will present at its Ct end, the peptide corresponding to the hemagglutinin (HA) epitope; and ii) the generation, by duplicating the region that constitutes the promoter for the sgRNA 4 synthesis, of plasmids containing a modified RNA 3 so as to allow the expression of the MP, CP and a fluorescent protein (GFP and RFP from English ¿Green Fluorescent Protein¿ and ¿Red Fluorescent Protein¿, respectively). These molecular tools will allow: i) to undertake co-immunoprecipitation (Co-IP) studies in order to identify cellular factors that interact with the P2 subunit of the viral replicase, and ii) direct and non-invasive visualization of the viral infection process.