Recombinant synthetic REA1 for elucidation of mechanical behaviors through electron cryo microscopy

Abstract

[ES] REA1 es uno de los factores de maduración ribosómico más complejo que podemos encontrar en el genoma eucariota. Promueve el paso de la subunidad pre-60s ribosomal del núcleo al citosol al eliminar los factores proteicos de ensamblaje Ymt1 y Rsa4. REA1 pertenece a la familia de proteínas AAA+ e hidroliza ATP para crear la fuerza mecánica necesaria para la eliminación de los factores de ensamblaje. El objetivo de este trabajo es estabilizar una conformación minoritaria de REA1, directamente involucrada en la generación de fuerza, mediante la formación de enlaces covalentes entre los dominios Top2 y el anillo AAA+. Basándonos en la información estructural disponible, identificamos posiciones adecuadas para la incorporación del aminoácido no convencional p-benzoil-L-fenilalanina (BPA) en REA1 mediante un enfoque de supresión del codón ámbar ¿amber codon supression¿. El objetivo es producir el entrecruzamiento entre los residuos de BPA incorporados y las cadenas laterales de los aminoácidos cercanos una vez la proteína está en la conformación esperada. Por tanto, enriqueciendo la conformación inestable de REA1 y pudiendo llevar a cabo estudios de crio-microscopía de alta resolución. Se diseñaron 8 pares de cebadores para introducir el codón de terminación ámbar en la posición deseada y se realizó el ensamblaje de Gibson para regenerar los plásmidos mutantes capaces de expresar REA1 recombinante. Los plásmidos fueron caracterizados mediante pruebas de digestión enzimáticas y secuenciación para verificar el éxito del ensamblaje de Gibson así como la correcta incorporación del codón de terminación ámbar. Finalmente, se realizó la expresión, y la purificación del REA1 recombinante de uno de los constructos de REA1-BPA. Para ello llevamos a cabo un escalado de cultivo de levaduras, una cromatografía de afinidad y una filtración en gel. Las proteínas recuperadas fueron observadas y caracterizadas mediante microscopía electrónica de tinción negativa para demostrar que la estructura de REA1 no se ve perturbada por la incorporación de BPA. Este trabajo se relaciona con los siguientes ODS de la Agenda 2030: [salud y bienestar y acción por el clima].

[EN] REA1 is one of the most complex eukaryotic ribosome maturation factors. It carries out the removal of the assembly factors Ymt1 and Rsa4 to promote the export of precursors of the large ribosomal subunit from the nucleus to the cytosol. REA1 belongs to the AAA+ protein family and hydrolyses ATP in its hexameric ring of AAA+ domains to create the mechanical force for assembly factor removal. The aim of this work was to stabilize a rare conformation of REA1, that is directly involved in this force generation, by site specific crosslinking. Based on the available preliminary structural information, we identified suitable positions for the incorporation of the non-natural amino-acid p-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) in REA1 via an amber-codon suppression approach. The medium-term future goal is to crosslink BPA with nearby amino-acid residues after UV- exposure to stabilize the rare REA1 conformation for high-resolution cryoEM studies. 8 primers pairs were designed to introduce the amber stop codon at the targeted position and carried out Gibson cloning to produce the corresponding REA1 expression plasmids. We characterized the plasmids by restriction enzyme test digests and sequencing to verify successful Gibson cloning and the correct incorporation of the amber stop codon. Finally, we expressed and purified one of the REA1-BPA constructs and carried out gel filtration chromatography and negative staining electron microscopy to prove that the REA1 fold is not disturped by BPA incorporation. This work is related to the following ODS from 2030 agenda: [health and well-being and climate action]