Rol de los receptores adenosinérgicos a2a y a2b en la modulación de las corrientes de potasio y la maduración de células precursoras de oligodendrocitos in vitro

Abstract

[ES] Es bien sabido que la señalización purinérgica (ATP y adenosina) juega un papel fundamental en numerosos sistemas biológicos, tanto en procesos a corto plazo (neurotransmisión, vasodilatación mediada por endotelio, agregación plaquetaria) y a largo plazo (proliferación celular, diferenciación, migración y muerte). Los oligodendrocitos (OLs) son células gliales del Sistema Nervioso Central (SNC) responsables de la deposición de la vaina de mielina y que se diferencian de sus progenitores, las células precursoras de oligodendrocitos (OPCs), no solo durante el desarrollo sino también a lo largo de la vida adulta. La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad incapacitante más común del SNC, con un patrón neurodegenerativo progresivo. Se caracteriza por la desmielinización de la sustancia blanca en el SNC y la apoptosis de los OLs. Además, los procesos de remielinización se ven obstaculizados debido a un fallo en la diferenciación a OLs maduros. Sin embargo, las terapias basadas en remielinización no están en uso clínico. La adenosina es un neuromodulador endógeno que puede afectar a múltiples funciones de las OPCs, como la migración, la proliferación y la maduración. Su función está regulada por la activación de receptores purinérgicos P1 específicos: A1, A2a, A2b y A3 (A1Rs, A2aRs A2bRs y A3Rs), que se encuentran en una amplia variedad de células. Sorprendentemente, los A1R facilitan la maduración y migración de las OPCs, mientras que los A3R inician la apoptosis en las OPCs. La estimulación selectiva de A2aRs o A2bRs inhibe la maduración de las OPCs al reducir las corrientes de K+ dependientes de voltaje, que son necesarias para la diferenciación celular. En concreto, esta estimulación de A2aRs y/o A2bRs conlleva la activación de la adenilil ciclasa que provoca un aumento del monofosfato de adenosina cíclico intracelular (cAMP), que, a su vez, cierra los canales de tipo Ik. La activación de A2bR también induce el bloqueo de los canales de tipo IA. Por lo tanto, el objetivo es explorar más a fondo el papel funcional de los receptores de A2a y A2b en la modulación de las corrientes de potasio y la maduración de OPC en cultivos de OPC mediante el uso de ligandos adenosinérgicos disponibles comercialmente y, por primera vez, un nuevo compuesto multidiana capaz de bloquear simultáneamente a A2aRs y A2bRs. Además, se ha caracterizado la implicación de A2aR y A2bR en la mielinización mediante el uso de cocultivos de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (GRD) junto con OPCs. Para conseguir el objetivo, se realizaron experimentos de whole-cell patch clamp, aislando OPCs provenientes de la corteza de crías de rata. Para estudiar la mielinización, se agregan OPCs a cultivos de DRGs aislados de crías de rata y se mantienen 14 días en medio neurobasal con triyodotironina (T3) para facilitar la mielinización. En primer lugar, se ha confirmado que BAY60-6583 (1-30 µM), un agonista selectivo de A2bR, reduce las corrientes de salida provocadas por un protocolo de rampa de voltaje (de -120 a +80 mV, 800 ms). Este efecto es bloqueado por el antagonista selectivo de A2bR, MRS1706 (10 µM), y por primera vez por el antagonista de A2aR y A2bR, P626 (100 nM). Por consiguiente, un agonista a la adenosina (50 µM), aplicado en presencia de los bloqueadores selectivos de A1R y A3R, DPCPX y MRS1523 respectivamente (ambos 500 nM), también inhibía las corrientes de salida de potasio. Y nuevamente, este efecto fue bloqueado por el antagonista P626. Luego, se encontró, usando análisis de inmunocitoquímica, que el tratamiento crónico con el agonista de A2bR, BAY60-6583, aumenta la mielinización de los axones de DRGs en el cocultivo DRGs-OPCs. En las mismas condiciones experimentales, no se encontraron efectos significativos de CGS21680 (50 nM), un agonista selectivo de A2aR. Estos resultados sugieren que la activación de A2aRs y A2bRs modula diferentes funciones en la oligodendrogliogénesis y por ello, pueden representar el objeto de estudio en patologías desm

[EN] It is well recognised that purinergic (ATP and adenosine) signalling plays a fundamental role in several biological systems, including both short-term (neurotransmission, endothelial-mediated vasodilatation, platelet aggregation) and long-term (cell proliferation, differentiation, migration and death) phenomena. Oligodendrocytes (OLs) are glial cells in the Central Nervous System (CNS) responsible for myelin sheath deposition and that differentiate from their progenitors, the oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), not only during development but also throughout adult life. Multiple Sclerosis is the most common disabling disease of the CNS, with a progressive neurodegenerative pattern. It is characterized by demyelination of white matter in CNS and apoptosis of OLs. In addition, remyelination processes are hindered due to a failure in the differentiation into mature OLs. However, remyelination therapies are not in clinical use. Adenosine is an endogenous neuromodulator that can affect numerous OPC functions such as migration, proliferation and maturation. Its actions are regulated by the activation of specific P1 purinergic receptors: A1, A2a, A2b and A3 receptors (A1Rs, A2aRs A2bRs and A3Rs), which are found in a wide variety of cells. Remarkably, A1Rs facilitate OPC maturation and migration, whereas A3Rs initiates apoptosis in OPCs. The selective stimulation of A2aRs or A2bRs inhibits OPCs maturation by reducing voltage-dependent K+ currents, which are necessary for cell differentiation. Specifically, this stimulation of A2aRs and/or A2bRs lead to adenylyl cyclase activation causing an increase in intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP), which, in turn, closes IK channels. A2bR activation also induces the block of IA currents. Thus, the aim is to further explore the functional role of A2aRs and A2bRs in modulating potassium currents and OPC maturation in cultured OPCs by using commercially available adenosinergic ligands and, for the first time, a new multitarget compound able to simultaneously block A2aRs and A2bRs. In addition, it has been characterized the involvement of A2aR and A2bR on myelination by using dorsal root ganglion (DRG) neurons/OPC co-cultures. In order to achieve the aim, whole-cell patch clamp experiments were performed, it has been isolated OPCs from rat pup cortices. To study myelination, OPCs are added to DRG cultures isolated from P5 rat pups and maintained 14 days in neurobasal medium with triiodothyronine (T3) to facilitate myelination. Firstly, it has been confirmed that BAY60-6583 (1-30 µM), a selective A2bR agonist, reduced outward currents caused by a voltage ramp protocol (from -120 to +80 mV, 800 ms). This effect was blocked by the selective A2bR antagonist MRS1706 (10 µM), and for the first time by the A2aR/A2bR antagonist, P626 (100 nM). Consistently, the endogenous agonist adenosine (50 µM), applied in the presence of A1R and A3R selective blockers DPCPX and MRS1523, respectively (both 500 nM), also inhibited outward ramp currents. And again this effect was blocked by the antagonist P626. Then, it was found, by using immunocytochemistry analysis, that chronic treatment with A2bR agonist BAY60-6583 increases the myelination of DRG axons in DRG-OPC co-culture. In the same experimental conditions, no significant effects of CGS21680 (50 nM), a selective A2aR agonist, were found. These results suggest that activation of A2aRs and A2bRs modulates different functions in oligodendrogliogenesis and may represent a valuable target in demyelinating pathologies, such as MS.