Generación de clones infecciosos del virus de los anillos necróticos de los Prunus (PNRSV) y del virus del enanismo de los Prunus (PDV) para estudios de los efectos sinérgicos en coinfecciones virales

Abstract

[ES] El virus de los anillos necróticos de los Prunus (PNRSV, del inglés prunus necrotic ringspot virus) y el virus del enanismo del cerezo (PDV, del inglés prune dwarf virus) son virus de RNA tripartitos de polaridad positiva que pertenecen al género Ilarvirus, familia Bromoviridae y son los virus más comunes que infectan al almendro (Prunus dulcis [Mill.] D.A. Webb). Las infecciones mixtas de PNRSV y PDV causan la enfermedad "Peach stunt" (enanismo del melocotonero) y están asociadas a la reducción del desarrollo de yemas y la formación de rosetas, dando lugar a arboles debilitados y menos productivos Para estudiar los posibles efectos sinérgicos entre estos dos virus en melocotonero y otros huéspedes, es necesario disponer de clones infecciosos que nos posibiliten el uso de secuencias únicas y la repetitividad de los experimentos desde el punto de vista de la fuente de inóculo. En este trabajo, hemos generado clones infecciosos de ambos virus utilizando diferentes enfoques moleculares. Inicialmente, caracterizamos los extremos 5’- y 3’-UTR de los tres RNA virales (vRNAs) de PNRSV y PDV mediante una modificación de la técnica RACE que emplea un cebador con una estructura tallo-bucle diseñado para unirse al final de la cola de poli(A). Posteriormente, mediante RT-PCR se amplificaron los cDNAs correspondientes a los tres vRNAs de cada virus y se clonaron en casetes de expresión. Estos casetes presentan promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador del inhibidor de proteasa de patata (PoPit), con o sin una secuencia de ribozima unida al extremo 3’ de los vRNAs. Así, se generaron diferentes construcciones en vectores binarios de cada uno de los dos virus: i) sistema tripartido (construcciones tripartidas), en el que cada vRNA esta clonado individualmente en el casete de expresión ii) sistema bipartido (construcción en tándem), en los que los cDNAs correspondientes a los vRNAs 1 y 2 están clonados en tándem en un único vector binario. Las construcciones tripartidas o en tándem fueron clonadas en dos tipos distintos de plásmidos binarios pMOG800 y pLX que presentan diferentes tamaños y diferentes eficiencias en la transformación de las plantas. Los cotiledones de plantas de pepino (Cucumis sativus Cv. Supermarketer) se agroinfiltraron con las diferentes construcciones de cada virus y la detección de RNA subgenómico (sgRNA) en hojas superiores no infiltradas confirmó la infectividad de los clones. Posteriormente, extractos crudos de los cotiledones se utilizaron como fuente de inóculo para, mediante inoculación mecánica, realizar infecciones mixtas PNRSV/PDV y analizar en detalle el efecto de estas co-infecciones. Este tipo de investigación es crucial para comprender los mecanismos moleculares de las infecciones virales, las interacciones con el huésped y el desarrollo de estrategias potenciales para el control o la resistencia a los virus en sus huéspedes naturales y/o de interés agronómico.

[EN] Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) and prune dwarf virus (PDV) are positive polarity tripartite RNA viruses belonging to the genus Ilarvirus, family Bromoviridae and are the most common viruses infecting almond trees (Prunus dulcis [Mill.] D.A. Webb). Mixed infections of PNRSV and PDV cause peach stunt disease and are associated with reduced bud development and rosette formation, resulting in weakened and less productive trees. To study the possible synergistic effects between these two viruses in peach and other hosts, it is necessary to have infectious clones that allow the use of unique sequences and repeatability of the experiments from the point of view of the inoculum source. In this work, we have generated infectious clones of both viruses using different molecular approaches. Initially, we characterised the 5’- and 3’-UTR ends of the three viral RNAs (vRNAs) of PNRSV and PDV using a modification of the RACE technique that employs a primer with a stem-loop structure designed to bind to the end of the poly(A) tail. Subsequently, cDNAs corresponding to the three vRNAs of each virus were amplified by RT-PCR and cloned into expression cassettes. These cassettes present the 35S promoter of Cauliflower mosaic virus (CaMV) and the terminator of Potato protease inhibitor (PoPit), with or without a ribozyme sequence attached to the 3’ end of the vRNAs. Thus, different binary vector constructs of each of the two viruses were generated: i) tri-partite system (tripartite constructs), in which each vRNA is cloned individually in the expression cassette ii) bipartite system (tandem construct), in which the cDNAs corresponding to vRNAs 1 and 2 are cloned in tandem in a single binary vector. The tripartite or tandem constructs were cloned into two different types of binary plasmids pMOG800 and pLX that have different sizes and different efficiencies in plant transformation. Cucumber (Cucumis sativus Cv. Supermarketer) plant cotyledons were agroinfiltrated with the different constructs of each virus and detection of subgenomic RNA (sgRNA) in uninfected upper leaves confirmed the infectivity of the clones. Subsequently, crude extracts of the cotyledons were used as a source of inoculum to perform mixed PNRSV/PDV infections by mechanical inoculation and to analyse in detail the effect of these co-infections. This type of research is crucial for understanding the molecular mechanisms of virus infections, host interactions and the development of potential strategies for control or resistance to the viruses in their natural and/or agronomically relevant hosts.