Empleo de la subclonación para la caracterización de variantes alélicas en el gen SAMD9L tras la técnica de edición genética CRISPR/CAS9.

Abstract

[ES] Las neoplasias mieloides hereditarias son un grupo de enfermedades clonales de la sangre y de la médula ósea caracterizadas por la proliferación incontrolada de mielocitos inmaduros, aumentando, como consecuencia, el número de células anómalas que circulan por la sangre. Se ha determinado que mutaciones germinales en el gen SAMD9L se asocian a esta patología. El objetivo global del proyecto es recrear cuatro variantes germinales detectadas en el gen SAMD9L, dos de las cuales están ya descritas, mientras que las otras dos son de novo y están clasificadas como de significado incierto. Para ello, se emplea la técnica de edición del genoma CRISPR/Cas9 junto con la técnica de electroporación en la línea celular HL-60. Se pretende estudiar el impacto de dichas mutaciones en células knock-in editadas, realizando ensayos funcionales in vitro e in vivo. En este contexto, existen varias formas de comprobar que las mutaciones puntuales se han introducido correctamente, siendo una de ellas la técnica de subclonación, en la que está basado este Trabajo Fin de Grado. Este proceso utiliza el plásmido pBlueScript como vector de clonación, sobre el cual se liga el inserto potencialmente editado. El inserto procede de la amplificación por PCR de la zona flanqueante al punto de edición en células electroporadas con ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y ssODN como ADN molde. A continuación, el producto de la ligación es transformado en bacterias E. coli competentes y sembradas en medio LB con ampicilina. Finalmente, se seleccionan las bacterias transformadas con el vector recombinado, y mediante la secuenciación por Sanger de los insertos, se comprueba si se han obtenido las variantes genéticas deseadas. El empleo de la subclonación ha permitido caracterizar las diferentes ediciones generadas en el gen SAMD9L mediante CRISPR/Cas9. Se han obtenido buenas eficiencias de recombinación para dos de las variantes estudiadas. En concreto, las variantes T233N y N697Y fueron recombinadas con una eficiencia del 26,32% y 46,67%, respectivamente.

[EN] Hereditary myeloid neoplasms are a group of clonal diseases of the blood and bone marrow characterized by the uncontrolled proliferation of immature myelocytes, consequently increasing the number of abnormal cells circulating in the blood. It has been determined that mutations in the SAMD9L gene are associated with this pathology. The overall objective of the project is to recreate four germline variants detected in the SAMD9L gene, two of which are already described, while the other two are de novo and have been classified as variant of uncertain significance. For this purpose, the CRISPR/Cas9 genome editing technique is used together with the electroporation technique in the HL-60 cell line. We intend to study the impact of these mutations in edited knock-in cells, performing functional assays in vitro and in vivo. In this context, there are several ways to check that the point mutations have been introduced correctly, one of them being the subcloning technique, on which this Final Degree Project is based. This process uses the pBlueScript plasmid as a cloning vector, on which the potentially edited insert is ligated. The insert is obtained by PCR amplification of the region flanking the edited site in cells electroporated with CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and ssODN as a template DNA. The ligation product is then transformed into competent E. coli bacteria and seeded in LB medium with ampicillin. Finally, bacteria transformed with the recombinant vector are selected, and Sanger sequencing of the inserts is used to check whether the desired genetic variants have been obtained. The use of subcloning allow us to characterize the different edits generated by CRISPR/Cas9. Good recombination efficiencies have been obtained for two of the variants studied. Concretely, the T233N and N697Y variants were recombined with an efficiency of 26.32% and 46.67%, respectively.