Optimización de la extracción de ADN de alto peso molecular de plantas silvestres para la obtención de genomas de referencia de alta calidad

Abstract

[ES] La extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) es un paso necesario para la generación de un genoma de referencia. Si bien se ha optimizado para varias especies de plantas modelo como Arabidopsis thaliana u Oryza sativa, aún presenta muchos desafíos para muchas plantas no modelo. La mayoría de las plantas son ricas en polisacáridos y metabolitos especializados como polifenoles y taninos que dificultan la extracción de ADN. La situación se agrava cuando se trabaja con plantas recolectadas de forma silvestre, ya que las plantas pueden haber sufrido estreses ambientales durante su vida que aumentan la presencia de estos compuestos especializados que dificultan la extracción de ADN de alta calidad. En este trabajo, hemos probado varios protocolos de extracción en seis especies de plantas mediterráneas (Limbarda crithmoides, Pistacia lentiscus, Phillyrea angustifolia, Reseda alba, Reseda barrelieri y Reseda hookeri) recolectadas en El Saler (Valencia) que tienen características que las hacen recalcitrantes a la extracción de ADN (p. ej., altas concentraciones de polisacáridos). Posteriormente, los resultados se han evaluado mediante métodos estándar de espectrofotometría, fluorometría y electroforesis en gel de agarosa con el objetivo de evaluar qué método puede ser más adecuado para la extracción de alta calidad y cantidad de ADN de alto peso molecular para cada una de las especies. Se probaron seis protocolos de extracción, incluidos métodos de extracción directa (CTAB, SILEX, DNAbsolute, CTAB modificado) y métodos de aislamiento de núcleos (PacBio, CellLytic). La efectividad de los protocolos varió significativamente entre especies debido a sus metabolitos y propiedades fisiológicas únicas. El aislamiento de núcleos de PacBio combinado con los kits Nanobind o PanDNA produjo la mayor cantidad y pureza de ADN para P. angustifolia, adecuado para la secuenciación de lectura larga. Otras especies produjeron rendimientos y pureza de ADN bajos, lo que a menudo requirió una mayor optimización.

[EN] High molecular weight (HMW) DNA extraction is a necessary step for the generation of a reference genome. While it has been optimized for several model plant species such as Arabidopsis thaliana or Oryza sativa, it still presents many challenges for many non-model plants. Most plants are rich in polysaccharides and specialized metabolites such as polyphenols and tannins that make DNA extraction difficult. The situation is aggravated when working with plants collected from the wild, since plants may have suffered environmental stresses during their life that increase the presence of these specialized compounds that hinder the extraction of high-quality DNA. In this work, we have tested several extraction protocols in six Mediterranean plant species (Limbarda crithmoides, Pistacia lentiscus, Phillyrea angustifolia, Reseda alba, Reseda barrelieri and Reseda hookeri) collected in El Saler (Valencia) that have traits that make them recalcitrant to DNA extraction (e.g., high concentrations of polysaccharides). Subsequently, the results have been evaluated by standard methods of spectrophotometry, fluorometry and gel electrophoresis with the aim of evaluating which method may be more suitable for the extraction of high quality and quantity of HMWDNA for each of the species. Six extraction protocols were tested, including direct extraction methods (CTAB, SILEX, DNAbsolute, modified CTAB) and nuclei isolation methods (PacBio, CellLytic). The protocols' effectiveness varied significantly across species due to their unique metabolites and physiological properties. The PacBio nuclei isolation combined with Nanobind or PanDNA kits yielded the highest DNA quantity and purity for P. angustifolia, suitable for long-read sequencing. Other species produced low DNA yields and purity, often requiring further optimization.