Optimización y miniaturización de ensayos de "Cell Painting" para el estudio y descubrimiento de fármacos

Abstract

[ES] El objetivo del modelo experimental desarrollado en los ensayos de Cell Painting fue caracterizar, a partir de perfiles morfológicos celulares definidos, los cambios sobre las células provocados por diferentes condiciones experimentales de interés. El primer paso fue generar perfiles morfológicos celulares. El tratamiento de células en cultivo con una serie de fármacos cuyo efecto sobre la célula se conoce, la posterior tinción con una combinación de marcadores fluorescentes frente a diferentes orgánulos celulares, y la adquisición en un microscopio de fluorescencia automatizado, genera un conjunto de imágenes que permitieron obtener los perfiles celulares debidos al tratamiento con fármacos conocidos. Una vez generados, estos perfiles podrían ser utilizados para comparar con los perfiles extraídos de imágenes tras el tratamiento con fármacos de efecto desconocido, o de otras condiciones experimentales de interés. Previamente, en un trabajo realizado en el Servicio de Citómica del CIPF, se inició la puesta a punto de los ensayos de Cell Painting , con los fármacos de efecto conocido, con el fin de generar los perfiles morfológicos celulares. Debido a problemas experimentales, no se pudo realizar la puesta a punto completa. En el trabajo que se presenta, se lleva a cabo la miniaturización del ensayo en placas de cultivo de 384 pocillos, para adaptarlo a ensayos de alto rendimiento, utilizando equipos de lavado y tinción automatizados, con el fin de asegurar la reproducibilidad del ensayo. Además, se realiza la optimización del protocolo de adquisición de imágenes, generando a partir del protocolo de 5 parámetros celulares, dos protocolos de 4 parámetros celulares cada uno, con el objetivo de adaptarlo mejor al equipo del que se dispone en el Servicio de Citómica. El programa de análisis de imagen Cell Profiler ha sustituido al utilizado con anterioridad, debido a su mayor potencia de extracción de datos. Estos cambios en el protocolo experimental, en la adquisición de imágenes y en el análisis de resultados, ha permitido la generación de los perfiles morfológicos celulares. Los resultados obtenidos muestran una mejora en la calidad de las imágenes, así como un incremento en la reproducibilidad interensayo. A su vez, los perfiles morfológicos generados se han testado mediante un análisis dirigido, validando la capacidad del ensayo para identificar cambios morfológicos significativos inducidos por diversos fármacos.

[EN] The objective of the experimental model developed in the "Cell Painting" assays was to characterize, based on defined cellular morphological profiles, the changes in cells caused by different experimental conditions of interest. The first step was to generate cellular morphological profiles. Treating cultured cells with a series of drugs whose effects on the cell are known, followed by staining with a combination of fluorescent markers targeting different cellular organelles, and acquisition using an automated fluorescence microscope, generates a set of images that allowed obtaining the cellular profiles due to treatment with known drugs. Once generated, these profiles could be used to compare with profiles extracted from images after treatment with drugs of unknown effect, or other experimental conditions of interest. Previously, in a study conducted at the Cytomics Service of CIPF, the setup of "Cell Painting" assays was initiated using drugs of known effect to generate cellular morphological profiles. Due to experimental problems, the complete setup could not be achieved. In the present work, the miniaturization of the assay in 384-well culture plates was carried out to adapt it to high-throughput assays, using automated washing and staining equipment to ensure assay reproducibility. Additionally, the image acquisition protocol was optimized, generating two protocols of 4 cellular parameters each from the original 5-parameter protocol, to better adapt it to the equipment available at the Cytomics Service. The image analysis program Cell Profiler replaced the previously used program due to its greater data extraction capability. These changes in the experimental protocol, image acquisition, and result analysis have enabled the generation of cellular morphological profiles. The obtained results show an improvement in image quality, as well as an increase in inter-assay reproducibility. Furthermore, the generated morphological profiles have been tested through targeted analysis, validating the assay's capability to identify significant morphological changes induced by various drugs.