Estudio del papel de THT y TWi en la longevidad de las semillas y caracterización de respuesta defensiva mediada por serotonina y melatonina en plantas de tomate

Abstract

[ES] El tomate (Solanum lycopersicum) es un cultivo de gran importancia económica a nivel mundial, con una amplia diversidad genética que ha permitido su adaptación a diferentes condiciones climáticas y preferencias de consumo. Se trata de un cultivo abundante en compuestos como licopeno, vitamina C y diversos compuestos fenólicos. Su producción se enfrenta a desafíos importantes, tanto bióticos como abióticos. Entre los de tipo biótico se encuentran los producidos por enfermedades y plagas que pueden ser causadas por viroides, virus, bacterias, hongos o insectos. En respuesta a estos estreses de tipo biótico, se ha descrito que las plantas de tomate acumulan una mayor cantidad de compuestos fenólicos, entre los que se encuentran las amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) y los flavonoides. Por su parte, se ha descrito que derivados del triptófano como la serotonina y melatonina confieren tolerancia a estreses de tipo abiótico (revisado en Kaur et al. 2015), aunque su posible papel frente a estreses bióticos en tomate no ha sido descrito hasta la fecha.

El último paso de la biosíntesis de las HCAAs es catalizado por el enzima tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). Por su parte, la mayoría de los flavonoides acumulan en planta en forma de glicoconjugados, por la acción de glicosiltransferasas. En particular, la glicosiltransferasa Twi1 muestra actividad in vitro frente a los flavonoides quercetina y kaempferol. Por su parte, la triptófano descarboxilasa de tomate SlTDC2 juega un papel fundamental en la biosíntesis de serotonina (Tsunoda et al., 2021).

Recientemente, se ha descrito que los compuestos fenólicos juegan un papel muy importante en la longevidad de las semillas de Arabidopsis thaliana (Niñoles et al., 2023). Con el fin de estudiar el papel de las HCAAs y los flavonoides en la longevidad de las semillas de tomate, en este trabajo se han caracterizado plantas transgénicas de tomate generadas en nuestro laboratorio en fondo MoneyMaker (MM), con niveles alterados de estos compuestos fenólicos. Específicamente, se han empleado plantas que sobreexpresan el gen THT (35S:THT; Campos et al., 2014) y plantas que silencian el gen Twi1 (RNAi_Twi1; Campos et al., 2019). Para ello, se han analizado tanto la degradación de las semillas, mediante una tinción con tetrazolio, como la tasa de germinación de las semillas envejecidas a distintos tiempos de tratamiento tras la aplicación de un tratamiento de envejecimiento acelerado a las semillas de las líneas transgénicas y su fondo genético MM. También, se han realizado comparaciones fisiológicas, evaluando el crecimiento y desarrollo de las plantas tanto in vitro como in vivo.

Por otra parte, y con el fin de estudiar el posible papel de la serotonina y la melatonina en la respuesta defensiva de plantas de tomate, se ha analizado la expresión diferencial mediante RTqPCR de los genes implicados en la ruta biosintética de las moléculas de serotonina, tales como SlTDC2, como respuesta a diferentes tipos de estreses tanto bióticos, incluyendo herida e infecciones bacterianas y virales, como abióticos sometiéndolas a altas temperaturas. Además, se ha evaluado la efectividad de los tratamientos exógenos con serotonina o melatonina sobre la actividad defensiva.

Los resultados de este Trabajo de Fin de Grado destacan la importancia de los HCAAs y flavonoides en el desarrollo de raíces, y el papel defensivo de la serotonina y melatonina en situaciones de estrés frente patógenos y condiciones adversas. Las plantas transgénicas 35S:THT, con mayor contenido de HCAAs, han demostrado tener raíces principales más cortas y menos raíces laterales, mientras que las plantas RNAi_TW1, con niveles alterados de flavonoides, muestran una mayor longitud de la raíz principal y una longevidad de semilla reducida, indicando que los flavonoides son de gran relevancia en el desarrollo de raíz y semilla. La expresión del gen SlTDC2 se ha visto afectada bajo diversas condiciones de estrés, evide

[EN] The tomato (Solanum lycopersicum) is a crop of great economic importance worldwide, with a wide genetic diversity that has allowed its adaptation to different climatic conditions and consumer preferences. It is abundant in compounds such as lycopene, vitamin C, and various phenolic compounds. Its production faces significant challenges, both biotic and abiotic. Among the biotic challenges are those caused by pests and diseases that can be caused by viroids, viruses, bacteria, fungi, or insects. In response to these biotic stresses, it has been described that tomato plants accumulate a greater amount of phenolic compounds, including hydroxycinnamic acid-derived amides (HCAAs) and flavonoids. Meanwhile, derivatives of tryptophan, such as serotonin and melatonin, have been described to confer tolerance to abiotic stresses (reviewed in Kaur et al., 2015), although their possible role against biotic stresses in tomatoes has not been described to date. The final step of HCAAs biosynthesis is carried out by the enzyme tyramine hydroxycinnamoyl transferase (THT). On the other hand, most flavonoids accumulate in plants in the form of glycoconjugates, through the action of glycosyltransferases. In particular, the glycosyltransferase Twi1 shows in vitro activity against the flavonoids quercetin and kaempferol. Meanwhile, tomato tryptophan decarboxylase SlTDC2 plays a fundamental role in serotonin biosynthesis (Tsunoda et al., 2021). Recently, it has been described that phenolic compounds play a very important role in the longevity of Arabidopsis thaliana seeds (Niñoles et al., 2023). In order to study the role of HCAAs and flavonoids in the longevity of tomato seeds, this work has characterized plants generated in our laboratory in the MoneyMaker (MM) background, with altered levels of these phenolic compounds. Specifically, plants overexpressing the THT gene (35S; Campos et al., 2014) and plants silencing the Twi1 gene (RNAi_Twi1; Campos et al., 2019) were used. For this purpose, both seed degradation, through staining with tetrazolium, and the germination rate of aged seeds at different treatment times after applying an accelerated aging treatment to the seeds of the transgenic lines and MM control were analyzed. Furthermore, physiological comparisons were made, evaluating plant growth and development both in vitro and in vivo. On the other hand, in order to study the possible role of serotonin and melatonin in the defensive response of tomato plants, the differential expression was analyzed via RT-qPCR of genes involved in the biosynthetic pathway of serotonin molecules, such as SlTDC2, as a response to different types of stresses, both biotic, including wound and bacterial and viral infections, and abiotic, subjecting them to high temperatures. Additionally, the effectiveness of treatment with exogenous serotonin and melatonin on defensive activity was evaluated.Our results could contribute to the development of strategies to increase the resistance and yield of tomato crops against biotic and abiotic stresses, thus contributing to ensuring the availability and quality of this important food source. The results of this Bachelor's Thesis highlight the importance of HCAAs and flavonoids in root development, as well as the defensive role of serotonin and melatonin under stress conditions involving pathogens and adverse environments. The transgenic 35S:THT plants, with higher HCAA content, have demonstrated shorter primary roots and fewer lateral roots, while RNAi_TW1 plants, with altered flavonoid levels, show greater primary root length and reduced seed longevity, indicating that flavonoids play a significant role in root and seed development. The expression of the SlTDC2 gene has been affected under various stress conditions, demonstrating the role of serotonin and melatonin in adaptation and defense. Furthermore, melatonin treatments induce bacterial resistance, showcasing its defensive efficacy in tomato plants. These findings could