Estudio de la integridad del DNA asociada a la vulnerabilidad de la placa de ateroma en pacientes con estenosis de carótida

Abstract

[ES] Estudios previos a demostrado que la integridad del DNA libre circulante (cfDNA) puede tener valor diagnóstico en diferentes patologías. Recientemente, la integridad del cfDNA (cfDI) en el plasma se ha postulado como un indicador de la arteriosclerosis, sin embargo, su aplicación en el contexto concreto de la estenosis de carótida asociada a sintomatología neurológica ha sido escasamente explorado hasta la fecha.

Nuestro estudio se enfocó en evaluar el potencial diagnóstico de la cfDI en la estenosis de carótida sintomática, siendo la obtención de plasma un método rápido, fácil y mínimamente invasivo.

Una de las limitaciones iniciales del estudio era la poca cantidad de plasma disponible para análisis, por lo que la primera etapa consistió en evaluar el rendimiento y optimizar diferentes kits de extracción disponibles en el mercado, adaptados a la obtención de cfDNA a partir de pequeños volúmenes de plasma. Una vez identificado el método más efectivo, procedimos a aislar el cfDNA demuestras de plasma de pacientes con estenosis de carótida sintomática (casos) y asintomática (controles) obtenidas durante la cirugía de endarterectomía carotídea.

Para evaluar la cfDI, realizamos una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real de fragmentos de genes de diferentes tamaños, fragmentos cortos (52 y 115 pares de bases) y fragmentos largos (entre 211 y 339 pares de bases), y calculamos la concentración de cada fragmento mediante la interpolación en una curva estándar preparada con DNA extraído de sangre total. La cfDI se estimó como el ratio entre los fragmentos largos y cortos de cada gen. Finalmente, comparamos las concentraciones de los diferentes fragmentos, así como la cfDI de los distintos genes, entre los grupos clínicos analizados.

[EN] Previous studies have shown that the integrity of circulating free DNA (cfDNA) can have diagnostic value in different pathologies. Recently, cfDNA integrity (cfDI) in plasma has been postulated as an indicator of atherosclerosis, however, its application in the specific context of carotid stenosis associated with neurological symptomatology has been scarcely explored to date.

Our study focused on evaluating the diagnostic potential of cfDI in symptomatic carotid stenosis, with plasma collection being a quick, easy and minimally invasive method.

One of the initial limitations of the study was the small amount of plasma available for analysis, so the first stage was to evaluate the performance and optimise different commercially available extraction kits adapted to obtain cfDNA from small volumes of plasma. Once the most effective method was identified, we proceeded to isolate cfDNA from plasma samples from patients with symptomatic (cases) and asymptomatic (controls) carotid stenosis obtained during carotid endarterectomy surgery.

To assess cfDI, we performed real-time quantitative PCR amplification of gene fragments of different sizes, short fragments (52 and 115 base pairs) and long fragments (between 211 and 339 base pairs), and calculated the concentration of each fragment by interpolating on a standard curve prepared with DNA extracted from whole blood. The cfDI was estimated as the ratio between the long and short fragments of each gene. Finally, we compared the concentrations of the different fragments, as well as the cfDI of the different genes, between the clinical groups analysed.