Identification of New Circulating Biomarkers for the Characterization and Non-Invasive Diagnosis of Cardiac Rejection

Abstract

[ES] Aproximadamente 57 millones de adultos sufren insuficiencia cardíaca en todo el mundo y el trasplante cardíaco sigue siendo el tratamiento de referencia, en ausencia de contraindicaciones, en pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada. A pesar de las mejoras en el tratamiento inmunosupresor, uno de los principales eventos tras el trasplante es el rechazo agudo (rechazo celular agudo (RCA) y el rechazo mediado por anticuerpos (RMA). La biopsia endomiocárdica (BEM) es la técnica estándar para monitorizar el rechazo, pero presenta importantes limitaciones, como su carácter invasivo. Por lo tanto, la identificación de métodos no invasivos para reducir o eliminar la BEM es un campo de estudio abierto. La biopsia líquida es una alternativa potencial menos invasiva debido a su capacidad para reflejar los cambios fisiopatológicos producidos en los órganos durante un evento. Los enfoques ómicos han permitido el descubrimiento de moléculas libres circulantes en sangre como biomarcadores de enfermedad, destacando el potencial de los ARNs por su papel en procesos inflamatorios, especificidad tisular y estabilidad en fluidos biológicos. Por ello, esta Tesis Doctoral se ha centrado en identificar ARNs libres circulantes alterados en el torrente sanguíneo tras un trasplante de corazón desde un enfoque transcriptómico y estudiar la capacidad diagnóstica para su uso como biomarcadores de rechazo cardíaco (RCA [no rechazo (0R), leve (1R) y moderado-grave (≥2R)] y RMA [no rechazo (pRMA0) y rechazo histopatológico e inmunopatológico (pRMA2)]). Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral mostraron una desregulación en varios biotipos de ARNs libres circulantes tras el trasplante cardíaco en condiciones de rechazo. Observamos alteraciones en genes relacionados con el sarcómero; y el gen que codifica la alfa-actina cardiaca (ACTC1) mostró la mejor capacidad diagnóstica (≥2R área bajo la curva (AUC)=1,000, p<0,0001). Además, determinamos los niveles de la proteína ACTC1 en una cohorte mayor de pacientes, corroborando los hallazgos previos (AUC=0,702, p<0,05). Además, identificamos varios miARNs alterados en el suero de pacientes con RCA, concretamente miR-144-3p mostró los mejores resultados. En la fase de validación tuvo una capacidad diagnóstica excelente para el rechazo ≥2R (AUC=0,801, p<0,0001); sin embargo, su capacidad para detectar el rechazo 1R fue limitada (AUC=0,631, p<0,01). Así pues, analizamos y validamos la combinación de miR-144-3p y miR-652-3p, otro miARN identificado en la fase de descubrimiento. La combinación mejoró el poder diagnóstico (≥2R AUC=0,892, p<0,0001; 1R AUC=0,794, p<0,0001). Además, analizamos por primera vez la presencia en suero de otros biotipos de ARNs no codificantes tras un trasplante cardíaco. En concreto, identificamos 5 lncARNs (AC008105.3, AC006525.1, AC011455.8, AL359220.1, y AC025279.1) con capacidad diagnóstica excelente para la detección de los grados ≥2R (AUC de 0,850 a 1,000) y 1R (AUC de 0,750 a 0,854). Por otro lado, identificamos 7 piARNs (piR-169894, piR-181318, piR-1981088, piR-2479902, piR-380748, piR-398377 y piR-401292) con un perfil de expresión coincidente en suero y BEM. A continuación, validamos la combinación de estos piARNs en una cohorte mayor independiente (≥2R AUC=0,819, p<0,0001; 1R AUC=0,721, p=0,001). Además, nuestro panel de piARNs mostró un excelente poder diagnóstico de RMA (AUC=0,967, p<0,0001). Nuestros resultados demuestran la existencia de alteraciones en la expresión de ARNs libres circulantes (mARN, miARN, lncARN y piARN) en pacientes con rechazo cardíaco tras un trasplante, demostrando además una potente capacidad diagnóstica para los diferentes grados de RCA, incluso para el grado de rechazo leve. Además, una adecuada combinación de ARNs libres circulantes muestra mayor precisión para el diagnóstico del RCA que la detección individual de cada molécula, mostrando una excelente capacidad de diagnóstico del RMA y permitiendo monitorizar la respuesta al tratamiento.

[CA] Aproximadament 57 milions d'adults patixen insuficiència cardíaca a tot el món i el trasplantament cardíac continua sent el tractament de referència en absència de contraindicacions en pacients amb insuficiència cardíaca avançada. Malgrat les millores en el tractament immunosupressor, un dels principals esdeveniments després del trasplantament és el rebuig agut (rebuig cel·lular agut (RCA) i rebuig mediat per anticossos (RMA)). La biòpsia endomiocàrdica (BEM) és la tècnica estàndard per a monitorar el rebuig agut. No obstant això, la BEM presenta importants limitacions, com el seu caràcter invasiu. Per tant, la identificació de mètodes no invasius per a reduir o eliminar la BEM és un camp d'estudi obert. La biòpsia líquida és una alternativa potencial per a substituir a la BEM a causa de la seua capacitat per a reflectir els canvis fisiopatològics produïts en els òrgans durant un rebuig. Els enfocaments òmics han permés el descobriment de molècules lliures circulants en el torrent sanguini com biomarcadors de malaltia, destacant el potencial dels ARNs pel seu paper en processos inflamatoris, especificitat tissular i estabilitat en fluids biològics. Per això, esta Tesi Doctoral s'ha centrat en identificar ARNs lliures circulants alterats en sang després d'un trasplantament de cor des d'un enfocament transcriptòmic i estudiar la capacitat diagnòstica per al seu ús com biomarcadors de rebuig cardíac (RCA [no rebuig (0R), lleu (1R) i moderat-greu (≥2R)] i RMA [no rebuig (pRMA0) i rebuig histopatològic i immunopatològic (pRMA2)]). Els resultats obtinguts en esta Tesi Doctoral van mostrar desregulació en diversos biotips d'ARN lliures circulants després del trasplantament cardíac en condicions de rebuig. Observem alteracions en gens relacionats amb el sarcòmer; i el gen que codifica l'alfa-actina cardíaca (ACTC1) va mostrar la millor capacitat diagnòstica (≥2R: àrea baix la corba (AUC)=1,000, p<0,0001). A més, determinàrem els nivells de proteïna ACTC1 en una cohort major de pacients, corroborant les troballes prèvies (AUC=0,702, p<0,05). A més, identificàrem alguns miARNs alterats en el sèrum de pacients amb RCA, concretament miR-144-3p va mostrar els millors resultats. En la fase de validació va tindre una capacitat diagnòstica excel·lent per al rebuig ≥2R (AUC=0,801, p<0,0001); no obstant això, la seua capacitat per a detectar el rebuig 1R va ser limitada (AUC=0,631, p<0,01). Així doncs, analitzàrem i validàrem la combinació de miR-144-3p i miR-652-3p, un altre miARN identificat en la fase de descobriment. La combinació va millorar el poder diagnòstic (≥2R AUC=0,892, p<0,0001 i 1R AUC=0,794, p<0,0001). A més, analitzem per primera vegada la presència en sèrum d'altres biotips de ARN no codificant després d'un trasplantament cardíac. En concret, identificàrem 5 lncARNs (AC008105.3, AC006525.1, AC011455.8, AL359220.1, i AC025279.1) amb capacitat diagnòstica excel·lent per a la detecció de graus ≥2R (AUC de 0,850 a 1,000) i 1R (AUC de 0,750 a 0,854). D'altra banda, identificàrem 7 piARNs (piR-169894, piR-181318, piR-1981088, piR-2479902, piR-380748, piR-398377, i piR-401292) amb un perfil d'expressió coincident en sèrum i BEM. A continuació, validàrem la combinació d'estos piARNs en una major cohort independent (≥2R AUC=0,819, p<0,0001 i 1R AUC=0,721, p=0,001). A més, el nostre panell de piARN va mostrar un excel·lent poder diagnòstic de RMA (AUC=0,967, p<0,0001). Els nostres resultats demostren l'existència d'alteracions en l'expressió de ARNs lliures circulants (mARN, miARN, lncARN i piARN) en pacients amb rebuig cardíac després d'un trasplantament, demostrant a més una potent capacitat diagnòstica per als diferents graus de RCA, fins i tot per al grau de rebuig lleu. A més, una adequada combinació de ARNs lliures circulants mostra major precisió per al diagnòstic del RCA que la detecció individual de cada molècula, mostrant també una excel·lent capacitat de diagnòstic del RMA i permetent monitorar la resposta al tractament.

[EN] Approximately 57 million adults globally suffer heart failure and heart transplantation remains the gold standard therapy, in the absence of contraindications, in advanced heart failure patients. Despite improvements in immunosuppressive treatment one of the main events after transplant is acute rejection (acute cellular rejection (ACR) and antibody-mediated rejection (AMR)). Endomyocardial biopsy (EMB) is the standard technique for monitoring acute rejection, but EMB presents important limitations such as its invasive nature. Therefore, the identification of non-invasive methods to reduce or eliminate surveillance EMB is an important and necessary open field of study. Liquid biopsy is a potential alternative to replace EMB due to its less invasive nature and capability to reflect pathophysiological changes produced in organs during an event. The omics approaches have allowed the discovery of free molecules circulating in the bloodstream as biomarkers of disease, highlighting the potential of RNAs for their role in inflammatory processes, tissue specificity and stability in biological fluids. Therefore, this Doctoral Thesis have focused on identifying altered circulating cell-free mRNAs, miRNAs, lncRNAs, and piRNAs in the bloodstream after heart transplantation from a transcriptomic approach and studying the diagnostic capacity for its use as biomarkers of cardiac rejection (ACR [non-rejection (0R), mild (1R) and moderate-severe (≥2R)], and AMR [non-rejection (pAMR0) and histopathologic and immunopathologic rejection (pAMR2)]). The results obtained in this Doctoral Thesis showed deregulation in several biotypes of cell-free RNAs after heart transplantation in rejection conditions. We observed alterations in genes related to the sarcomere; and the gene that encodes cardiac alpha-actin (ACTC1) showed the best diagnostic capacity (grade ≥2R: AUC=1.000, p<0.0001). Furthermore, we determined ACTC1 protein levels in a larger cohort of patients, corroborating previous findings (AUC=0.702, p<0.05). Moreover, we identified several miRNAs altered in the serum of patients with ACR, specifically miR-144-3p showed the best results. In the validation phase it had excellent diagnostic capacity for moderate-severe rejection (AUC=0.801 p<0.0001); however, its ability to detect mild rejection was limited (AUC=0.631, p<0.01). Thus, we analysed and validated the combination of miR-144-3p and miR-652-3p, another miRNA identified in the discovery phase. The combination improved diagnostic power for moderate-severe rejection (AUC=0.892, p<0.0001) and mild (AUC =0.794, p<0.0001) rejection. Furthermore, we analysed for the first time the presence in serum of other biotypes of ncRNA (lncRNA and piRNA) after heart transplantation. Specifically, we identified 5 lncRNAs (AC008105.3, AC006525.1, AC011455.8, AL359220.1, and AC025279.1) with excellent diagnostic capacity for detection of ≥2R (AUC of 0.850 to 1.000) and 1R (AUC of 0.750 to 0.854) grades. On the other hand, we identified 7 piRNAs (piR-169894, piR-181318, piR-1981088, piR-2479902, piR-380748, piR-398377, and piR-401292) with a coincident expression profile in serum and EMB. Next, we validated the combination of these piRNAs in a large independent cohort (grade ≥2R: AUC=0.819, p<0.0001 and grade 1R: AUC=0.721, p=0.001). Additionally, our piRNA panel showed excellent diagnostic power for AMR (pAMR2: AUC=0.967, p<0.0001). Our results demonstrate the existence of alterations in the expression of circulating free RNAs (mRNA, miRNA, lncRNA and piRNA) in patients with cardiac rejection after transplantation, also demonstrating a powerful diagnostic capacity for different grades of ACR, even for the grade of mild rejection. Besides, an appropriate combination of circulating free RNAs shows greater precision for the diagnosis of ACR than the single detection of each molecule, showing excellent AMR capacity diagnosis and allowing monitoring of the response to treatment.