Nuevos mecanismos basados en miARNs que regulan KAT1, el principal canal de K+ en las células oclusivas.

Abstract

[ES] Ahora mismo, la agricultura está siendo amenazada por los efectos del cambio climático, que aumenta la temperatura, cambia los patrones de precipitación del agua y genera eventos climáticos extremos. Todo esto provoca grandes pérdidas económicas y disminuye el rendimiento, la calidad y la sostenibilidad de las cosechas. Paralelamente, el aumento poblacional ha supuesto un aumento en la demanda de alimentos. Concretamente, en España, la mitad de los daños causados a la cosecha se debe a la sequía, que está desertificando el 75% de la superficie del suelo y está suponiendo pérdidas millonarias anuales.

Debido a esto, hay un interés creciente en generar plantas tolerantes a alta temperatura, salinidad y, sobre todo, a la sequía. La biotecnología supone una estrategia prometedora para generar tolerancias, identificar y seleccionar plantas tolerantes y propagar en cantidad plantas sanas. El primer paso para aplicarla consiste en estudiar los procesos de la planta que permiten mejorarla y dianas concretas sobre las que actuar. En este proyecto, nos hemos centrado en el proceso de apertura estomática, ya que, gran parte de la pérdida del H2O de la planta se produce por evaporación a través del orificio de los estomas. Nuestra diana es la proteína KAT1, principal canal de K+ en las células oclusivas de los estomas, cuya función promueve la apertura de los estomas. Identificar y controlar los mecanismos de regulación de esta proteína y su función puede permitir desarrollar estrategias para crear plantas tolerantes a sequía. El origen de esta línea de investigación fue descubrir en nuestro laboratorio que KAT1 se localiza exclusivamente en células oclusivas pese a forzar su sobreexpresión en todos los tipos celulares mediante el promotor constitutivo (CaMV 35S) en plantas de Arabidopsis thaliana (A. thaliana) transgénicas. En este trabajo hemos estudiado si estos resultados se deben a una regulación mediada por miARN.

Para lograr este objetivo, se emplearon varios sistemas modelo, incluida la expresión transitoria en Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) y la estable en A. thaliana. Estudiamos la regulación mediada por miARN nativos con capacidad de reconocer a KAT1 para los cuales ya teníamos construcciones para su sobreexpresión. Además, generamos la construcción 35S::HA-RFP_35S::KAT1-YFP con un mejor comportamiento para el análisis respecto al control interno HA-RFP. Ambos tipos de construcciones se co-expresaron transitoriamente en N. benthamiana mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltración). Para comprobar que la regulación se debía específicamente a los miARN, se utilizaron versiones mutadas de 35S::KAT1-YFP en las dianas de unión de los miARN. Además, se sobreexpresaron los miARN en estudio en plantas de A. thaliana 35S::KAT1-YFP mediante transformación estable mediada por Agrobacterium tumefaciens (floral dipping) con las construcciones ya disponibles.

En todos los casos, se cuantificó el mARN de KAT1 por qPCR y la cantidad de proteína KAT1 por Western Blot y por intensidad de la fluorescencia de KAT1-YFP en N. benthamiana. Todos los miARN redujeron la intensidad de la fluorescencia de WTKAT1 YFP y la recuperaron total o parcialmente con las correspondientes versiones mutadas; no se vio una reducción concluyente de mARN pero sí de cantidad de proteína. En A. thaliana, 2 de los miARN en estudio redujeron la intensidad de fluorescencia KAT1-YFP en sus líneas, respecto a las líneas control miRGUS, aunque tampoco se vio una reducción concluyente de mARN.