Regulación de SnRK1 por fosforilación de la serina 364

Abstract

[ES] Las plantas necesitan regular su homeostasis proteica para adaptarse a las condiciones cambiantes del ambiente y sobrevivir a diversos estreses. La proteína quinasa SnRK1 ( Sucrose non-fermenting-Related Kinase 1 ) es un regulador central de los niveles de energía en la planta, actuando a nivel de transcripción, traducción y metabolismo energético. Sin embargo, su ruta de señalización completa aún está por descubrir. Recientemente se ha demostrado que el cambio de localización subcelular de SnRK1 dependiente de SnRK2, es crucial para la inhibición de TOR y el crecimiento en respuesta a ácido abscísico (ABA). Basándonos en observaciones previas de nuestro laboratorio, planteamos la hipótesis de que la translocación de SnRK1 y/o la posterior inhibición de TOR en condiciones de ABA, podrían ser desencadenadas por la fosforilación de SnRK1 en un residuo específico de serina (S364), por uno o varios módulos de MPKs, incluido el compuesto por MKK3 y las MPKs de tipo C MPK1/2/7/14. Este trabajo final de máster tiene como objetivo proporcionar nuevos datos sobre la relevancia de la fosforilación de la S364 en la respuesta de las plantas a la escasez de agua (señalización de ABA). El estudio de la conservación de la S364 en diferentes especies vegetales, junto con la predicción del impacto de su fosforilación sobre la estructura de la proteína, indican que la S364 de SnRK1α1 está altamente conservada entre diversas especies vegetales y que su fosforilación no afectaría la estructura de la proteína. El análisis de la importancia fisiológica de esta fosforilación, realizado mediante el estudio del crecimiento y la localización subcelular de SnRK1α1 en condiciones control y de ABA, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan versiones fosfomiméticas (Ser a Asp) y fosfomutantes (Ser a Ala) de SnRK1α1, muestra que la fosfomutación y la fosfomimetización de la S364 afectarían tanto al crecimiento de la raíz principal como a su sensibilidad al ABA, aunque no alterarían la localización subcelular de la proteína. Además, la fosforilación de la S364 no afecta la actividad quinasa de una versión activada de SnRK1α1. En este trabajo, también se estudió el papel de la proteína MKK3 en la fosforilación de la S364 de SnRK1α1 in planta, así como su interacción genética con las SnRK2s. En condiciones favorables, los mutantes mkk3-1 presentan un mayor crecimiento de la raíz principal que no se correlaciona con una disminución de la fosforilación de la S364 en estas condiciones. El crecimiento de la raíz principal de mutantes mkk3-1 es completamente revertido por la pérdida de función de SnRK2.2 y SnRK2.3, lo que indica que éstas son dominantes sobre MKK3. Si bien los mutantes mkk3-1 podrían presentar niveles alterados de la fosforilación de la S364 en condiciones de ABA, esta alteración parece no ser significativa, ya que la pérdida de función de MKK3 parece no afectar la sensibilidad a ABA en cuanto al crecimiento de la raíz principal. Estos hallazgos, podrían descartar un papel relevante de MKK3 en la regulación del crecimiento a través de la fosforilación de la S364 de SnRK1α1. Finalmente, para explorar la regulación de la fosforilación de la S364 de SnRK1α1 por otras cascadas de MPKs y/o estímulos, se analizó esta fosforilación en respuesta al tratamiento con flg22, que simula una respuesta inmunitaria en las plantas al activar cascadas de MPKs, involucrando a MPK3/4/6/11. El tratamiento con flg22 causa un aumento de la fosforilación de la S364, que podría estar relacionado con un incremento en la actividad de la proteína. Estos resultados proporcionan nuevos datos sobre la regulación de SnRK1α1 y abren nuevas posibilidades para entender cómo las plantas coordinan respuestas a diferentes tipos de estrés, a través de la regulación de la fosforilación de SnRK1α1 en residuos clave como la serina 364.

[EN] Plants need to regulate their protein homeostasis to adapt to changing environmental conditions and survive different stresses. The kinase SnRK1 (Sucrose non-Fermenting-related protein Kinase 1) is a central regulator of energy levels in plants, acting at the levels of transcription, translation and energy metabolism. However, its complete signaling pathway remains to be discovered. Recent studies have demonstrated that the SnRK2-dependent subcellular relocalization SnRK1 dependent on SnRK2 is crucial for TOR inhibition and growth in response to abscisic acid (ABA). Based on prevoius observations from our laboratory, we hypothesized that SnRK1 translocation and/or the subsequent TOR inhibition under ABA conditions could be triggered by SnRK1 phosphorylation at a specific serine residue (S364) by one or more MAPK modules, including the module formed by MKK3 and the type C MPKs MPK1/2/7/14. This master's thesis aims to provide new insights into the relevance of S364 phosphorylation in the plant response to water scarcity (ABA signaling). The study of S364 conservation across different plant species, along with predictions of the structural impact of its phosphorylation, indicates that S364 in SnRK1α1 is highly conserved among diverse plant species and that its phosphorylation would not affect protein structure. The physiological significance of this phosphorylation was analyzed by studying the growth and subcellular localization of SnRK1α1 under control and ABA conditions. This analysis was conducted using transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing phosphomimetic (Ser to Asp) and phosphomutant (Ser to Ala) versions of SnRK1α1. The results show that S364 phosphomutation and phosphomimetics affect both primary root growth and ABA sensitivity, although they do not alter the subcellular localization of the protein. Furthermore, S364 phosphorylation does not impact the kinase activity of a constitutively active version of SnRK1α1. This work also investigates the role of MKK3 in S364 phosphorylation of SnRK1α1 in planta and its genetic interaction with SnRK2s. Under favorable conditions, mkk3-1 mutants exhibit increased primary root growth that does not correlate with a reduction in S364 phosphorylation under these conditions. The primary root growth phenotype of mkk3-1 mutants is completely reverted by the loss of function of SnRK2.2 and SnRK2.3, indicating that these kinases are dominant over MKK3. Although mkk3-1 mutants may exhibit altered S364 phosphorylation levels under ABA conditions, this alteration does not seem significant, as MKK3 loss-of-function does not affect ABA sensitivity in terms of primary root growth. These findings may rule out a significant role for MKK3 in regulating growth through S364 phosphorylation of SnRK1α1. Finally, to explore the regulation of S364 phosphorylation by other MPK cascades and/or stimuli, this phosphorylation was analyzed in response to flg22 treatment, which simulates an immune response in plants by activating MPK cascades, including MPK3/4/6/11. Flg22 treatment induces an increase in S364 phosphorylation, which may correlate with increased protein activity. These results provide new insights into the regulation of SnRK1α1 and open new avenues for understanding how plants coordinate responses to different types of stress through the regulation of SnRK1α1 phosphorylation at key residues such as serine 364.