Abstract:
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[EN] MAPK activation in mammals is a signal transduction pathway which permits cell response to a variety of stimuli. It regulates fundamental processes such as proliferation, differentiation, apoptosis and survival. ...[+]
[EN] MAPK activation in mammals is a signal transduction pathway which permits cell response to a variety of stimuli. It regulates fundamental processes such as proliferation, differentiation, apoptosis and survival. Impairing this cascade could give rise to different pathologies, which makes MAPK pathway a promising therapeutic target. ERK cascade is one of the most known MAPK pathways, in which Ras and Raf signaling proteins participate. Ras is a small GTPase which functions as a nucleotide- dependent switch between GDP and GTP. Its binding to GTP gives rise to conformational changes which increase its affinity to Raf. Raf is a protein- serine/threonine kinase whose structure is formed by three conserved regions involved in the activation and deactivation of the protein and regulating signal transmission. Most studies of the interaction of Ras and Raf are based on H-Ras and Raf-1. However, mutated K-Ras results in a great incidence in cancer. Characterization of the manner in which K-Ras and Raf-1 interact could provide some insights in the development of new treatments against cancer. Cloning strategy by using recombiant vectors provided the correct tag for purification protocols. The expression system used for these fusion proteins was based on BL21 or BL21 codon plus strains of E.coli. K-Ras and Raf-1 purification by using both affinity chromatography and molecular size exclusion chromatography yielded significant protein levels for the experimental procedure described. Ras binding domain (RBD) involving residues 51 to 131 of Raf-1 was enough to interact with Ras. Binding characterization by using techniques such as pull down or isothermal titration calorimetry (ITC) verified the interaction between K-Ras and Raf-1. Future strategies will include crystallization series in order to structurally define the binding complex between these two proteins.
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[ES] La vía de activación de las MAPK en mamíferos es una ruta de transducción de señale que permite a la célula responder frente a un amplio rango de estímulos y dirigir procesos como la proliferación, diferenciación, ...[+]
[ES] La vía de activación de las MAPK en mamíferos es una ruta de transducción de señale que permite a la célula responder frente a un amplio rango de estímulos y dirigir procesos como la proliferación, diferenciación, apoptosis y supervivencia celular. La desregulación de esta ruta está implicada en diferentes patologías, lo que la convierte en una diana terapéutica de gran interés. Una de las vías MAPKs más conocidas es la mediada por ERK, que se caracteriza por la intervención de dos proteína señalizadoras, Ras y Raf. Ras es un GTPasa pequeña cuya función biológica queda regulada a través de su unión a un nucleótido guanina GDP o GTP, de forma que su unión a GTP favorece que se produzca un cambio conformacional que incrementa su afinidad por Raf. Raf es una serina/treonina quinasa formada por tres dominios conservados, los cuales intervienen tanto en los procesos de activación e inactivación de la proteína como de transmisión de la señal. La mayoría de los estudios de interacción entre Ras y Raf descritos hasta el momento se basan en H-Ras y Raf-1. Sin emabrgo, la incidencia de cáncer cuando K-Ras se encuentra mutada es mayor, por lo que el estudio de su modo de unión con Raf-1 resulta de gran relevancia en el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. El clonaje en vectores recombinantes permitió la adquisión de etiquetas que facilitarían la purificación posterior. El sistema de expresión utilizado para las proteínas de fusión fueron las cepas BL21 o BL21 codon plus de E.coli. La purificación de K-Ras y Raf-1 por cromatografía líquida de afinidad empleando columnas de níquel y, posteriormente, por exclusión molecular mostró unos niveles significativos de proteína para el sistema experimental descrito. El dominio de unión a Ras (RBD) comprendido por los residuos 51 al 131 de Raf-1 fue suficiente para mediar su interacción con Ras. La caracterización del modo de unión mediante técnicas como pull-down o isothermal titration calorimetry (ITC) verificaron la interacción entre K-Ras y Raf-1. Las estrategias futuras comprenderán la disposición de series de cristalización que permitirán definir la estructura del complejo de interacción.
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