Caracterización fenotípica y genotípica de Staphylococcus coagulasa negativos resistentes a linezolid emergentes en un hospital de distrito durante los años 2012 – 2013

Abstract

[ES] Los Staphylococcus coagulasa negativos (SCN) se asocian a infecciones oportunistas nosocomiales, implicándose en ocasiones en casos graves de bacteremia. Habitualmente el tratamiento frente a estos microorganismos se basa, debido al elevado porcentaje de resistencia a meticilina, en la administración de glucopéptidos, como vancomicina o teicoplanina. No obstante, la aparición de cepas con sensibilidad disminuida a estos antimicrobianos ha llevado a la necesidad del empleo de nuevas alternativas, entre ellas el linezolid, una oxazolidinona activa frente a grampositivos resistentes, convirtiéndose en uno de los fármacos de uso habitual en este tipo de infecciones. Sin embargo, se localizan cada vez más frecuentemente cepas resistentes a este antibiótico. Esta resistencia puede estar mediada por 3 mecanismos diferentes: mutaciones en el gen rrn del dominio V del ARN 23S, adquisición del gen plasmídico cfr y/o mutaciones en los genes que codifican las riboproteínas L3 y L4. En este trabajo se llevó a cabo la caracterización fenotípica y genotípica de 67 cepas de SCN linezolid-resistentes aisladas de muestras de pacientes ingresados en el Servicio de Reanimación del Hospital Universitario Doctor Peset de Valencia durante los años 2012 - 2013. La caracterización fenotípica se realizó empleando diversos métodos de identificación bioquímica que incluían sistemas automatizados Vitek 2 (BioMérieux) y Microscan Walkaway (Siemens), los cuales proporcionan datos de identificación de especie y sensibilidad a diversos antimicrobianos y el método de dilución en placa Etest (BioMérieux), para la confirmación de las CMIs a linezolid, oxacilina, vancomicina, teicoplanina, tigeciclina y daptomicina. La meticilin-resistencia se confirmó además utilizando una prueba inmunocromatográfica de detección de PBP2a (Alére). Asimismo, se analizaron diferentes factores de riesgo para determinar una posible relación con el pronóstico del paciente. La caracterización genotípica consistió en el estudio del mecanismo de resistencia a linezolid, centrándonos en la detección del gen cfr y la mutación G2576T. Además, se confirmó la presencia del gen mecA que codifica resistencia a oxacilina. Paralelamente, se realizó la caracterización molecular de las cepas SCN mediante AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) utilizando como primer OPA-11, pudiendo así determinar la presencia de posibles clones. De los 67 aislados se identificaron 30 S. epidermidis, 23 S. haemolyticus, 9 S. hominis y 5 S. capitis. Todos mostraron resistencia a meticilina y linezolid, y sensibilidad a daptomicina y tigeciclina (alternativas utilizadas en casos de SCN linezolid-resistentes). Las CMIs de los glucopéptidos fueron elevadas frente a vancomicina, y con casos resistentes a teicoplanina. De los factores de riesgo analizados únicamente se encontró relación estadísticamente significativa entre la significación clínica que el médico dio a la presencia del SCN linezolid-resistente y el pronóstico del paciente. La meticilin-resistencia del total de aislados se confirmó mediante la detección de PBP2a y del gen mecA. El mecanismo de resistencia a linezolid hallado con mayor frecuencia entre los aislados fue la mutación G2576T del gen del dominio V del ARN 23S (77%), mientras que el gen cfr únicamente se detectó en el 25% de los casos. La AP-PCR dio como resultado la agrupación de los aislados en 5 posibles clones, detectándose dos clones cfr+ mantenidos a lo largo del estudio.

[EN] Coagulase-Negative Staphylococcus (CNS) are associated to opportunist nosocomial infections, getting sometimes involved in acute cases of bacteremia. Usually the treatment against these microorganisms is based, due to the high percentage of methicillin-resistance, on the administration of glycopeptides as vancomicyn or teicoplanin. Nevertheless, the appearance of strains with decreased sensibility towards these antimicrobials has managed to the need to use new alternatives, among them linezolid, an oxazolidinone active against resistant-grampositives, becoming a drug often used in these kind of infections. In spite of this, more and more linezolid-resistant strains are being located. This resistance can be mediated in three different ways: rrn gene mutations of RNAr 23S domain V, acquisition of gene cfr in one plasmid and mutations in the genes that encode L3 and L4 riboproteins. Throughout this work, a phenotypical and genotypical characterization of 67 isolated linezolid-resistant strains was done, strains that came from the Reanimation Service of the ‘Hospital Universitario Doctor Peset’, in Valencia, from 2012 to 2013. The phenotypical characterization was performed using several biochemical identification methods including the Vitek 2 (BioMérieux) and Microscan Walkaway (Siemens) automatized methods, which provide data about species identification and sensibility to different antimicrobials and the Ethest (BioMeriéux) plate dilution method, used to confirm the linezolid, oxacillin, vancomicyn, teicoplanin, tigecycline and daptomycin CMIs. Methicillin-resistance was also confirmed using the PBP2a (Alére) immunocromatographic detection test. Likewise several risk factors were analyzed in order to determinate a possible relation with the patient’s prognostic. The genotypical characterization consisted on the study of the linezolid-resistant mechanism, focusing on the detection of the cfr gene and the G2576T mutation. Besides, the presence of mecA gene which encodes oxicillin resistance was confirmed. At the same time, the molecular characterization of the SCN strains was done through AP-PCR using OPA-11 as primer, therefore being able to determinate the presence of possible clones. Out of 67 isolates, 30 were identified as S. epidermidis, 23 as S. haemolyticus, 9 as S. hominis and 5 as S. capitis. All of them showed resistance to methicillin and linezolid, and sensibility to daptomycin and tigecycline (alternatives used in linezolid-resistant CNS cases). Glycopeptides’ CMIs against vancomycin and teicoplanin were risen and some cases of teicoplanin-resistant were detected. Out of the risk factors analyzed only one of them showed statistical significance; the clinical signification of the linezolid-resistant CNS presence considered by the doctor and the prognostic of the patient. Methicillin-resistance of all the isolates was confirmed by the detection of PBP2a and the mecA gene. The most frequently linezolid-resistant mechanism found among the isolates was the G2567T mutation of the domain V of the 23S rRNA gene (77%), whereas the cfr gen only was detected at 25% of cases. AP-PCR gave as result the aggrupation of isolates within 5 possible clones, while two possible cfr+ clones where detected along the study.