Desarrollo y aplicación de un sistema integrativo de luciferasa para la cuantificación de la expresión génica in vivo

Abstract

[ES] La levadura es un organismo unicelular que está expuesto a un entorno cambiante, con lo cual puede sufrir distintos tipos de estrés. Para poder adaptarse de manera rápida y eficaz a este entorno cambiante y hacer frente al estrés, las levaduras han desarrollado mecanismos de defensa y adaptación. Estos mecanismos incluyen la síntesis de proteínas, fluctuaciones del ciclo celular, etc., siendo esencial los cambios es los patrones de expresión génica. Además, se conoce la existencia del fenómeno de memoria transcripcional. Este fenómeno consiste en que una célula que previamente ha sido expuesta a una dosis de estrés no letal, proporciona una respuesta más rápida y eficaz cuando es sometida a un estrés posterior en un periodo corto de tiempo. En este trabajo se ha utilizado el sistema luciferasa para medir los cambios en la expresión génica in vivo y a tiempo real. El objetivo de este trabajo fue la construcción de un sistema integrativo de luciferasa desestabilizada. Este sistema fue aplicado al promotor osmoinducible GRE2 de levadura y de esta manera se consiguió estudiar la dinámica transcripcional de este gen en respuesta a estrés, comparando la construcción integrativa con una construcción plasmídica desarrollada con anterioridad. Además, se estudió también el fenómeno de memoria transcripcional en el gen GRE2 en respuesta a estrés osmótico. Como conclusión, el sistema integrativo de luciferasa desestabilizada permitió el estudio a nivel genómico de la dinámica transcripcional en respuesta a estrés osmótico. Por otra parte, se observó que el gen GRE2 no presenta el fenómeno de memoria transcripcional observado en los genes GAL, confirmando la existencia de una “memoria negativa”. Además, se pudo confirmar que la exposición previa a estrés salino proporciona una defensa frente a una exposición a estrés oxidativo posterior.

[CA] El llevat és un organisme unicel·lular que es troba expost a un entorn canviant, per tant pot sofrir diferents tipus d’estrés. Amb el fi d’adaptar-se d’una manera rápida i eficaç a a aquest entorn canviant i fer front a l’estrés, el llevat ha desenvolupat mecanismes de defensa i d’adaptació. Aquests mecanismes inclouen la síntesi de proteïnes, fluctuacions del cicle cel·lular, etc., sent essencials els canvis als patrons d’expressió gènica. A més, es coneix l’existència del fenomen de memòria transcripcional. Aquest fenomen consisteix en que una cèl·lula, la qual prèviament ha estat exposta a una dosi d’estrés no letal, és capaç de respondre més rápida i eficaçment quan és sotmesa a un estrés posterior en un període curt de temps. En aquest treball ha sigut utilitzat el sistema luciferasa per a mesurar els canvis a l’expressió gènica in vivo i en temps real. L’objectiu d’aquest treball fou la construcció d’un sistema integratiu de luciferasa desestabilitzada. Aquest sistema fou aplicat al promotor induït per estrés osmòtic, GRE2, de llevat. D’aquesta manera es va aconseguir estudiar la dinàmica transcripcional d’aquest gen en resposta a estrés, comparant aquesta construcció integrativa amb una construcció plasmídica construïda amb anterioritat. A més, es va estudiar el fenomen de memoria transcripcional en el gen GRE2 en resposta a estrés osmòtic. Com a conclusió, el sistema integratiu de luciferasa desestabilitzada ha permés l’estudi a nivell genòmic de la dinàmica transcripcional en resposta a estrés osmòtic. D’altra banda, s’ha observat que el gen GRE2 no presenta el fenomen de memòria transcripcional descrit als gens GAL, confirmant així l’existència d’una “memòria negativa”. A més, s’ha pogut confirmar que l’exposició prèvia a estrés salí proporciona una defensa en front a una exposició a estrés oxidatiu posterior.

[EN] Yeasts are single-cell organisms which are exposed to a changing environment, so they can suffer several kinds of stress. In order to adapt in a rapid and effective way to the changing environment and cope with stress, yeasts have developped different mechanisms for defense and adaptation. These mechanisms involve protein synthesis, cell cycle fluctuations, etc., being changes in gene expression patterns essential to this purpose. In addition, transcriptional memory has been previously described. This phenomenon consists of cells which have been previously exposed to a non-lethal dose of stress that are able to respond more quickly and effectively to a second round of stress in a short period of time. In this work, a luciferase system has been used in order to measure changes in gene expression in vivo and in real-time. The purpose of this work was the construction of an integrative system of destabilized luciferase. This system was applied to the yeast osmoinducible promoter GRE2 in order to study transcriptional dynamics of this gene in response to osmostress, comparing this integrative construction to a previously developped plasmid construction of the same gene. In addition, transcriptional memory of this gene in response to osmostress was also studied. As a conclusion, we were able to study in the chromosomal context the transcriptional dynamics in response to osmostress of the GRE2 gene using the integrative system of destabilized luciferase. On the other hand, it was observed that the GRE2 gene doesn’t show a transcriptional memory as described for the GAL genes, confirming the existence of a “negative memory”. In addition, we were able to confirm that a previous exposure to a non lethal dose of salt stress favours the later defensive response to oxidative stress.