Optimization of transient transfection for the production of virus-like particles by extended gene expression

Abstract

[EN] Virus-like particles (VLPs) are biological construct that mimetize the viral natural structure without containing its genetic information. For this reason, they offer great promise as candidates for new vaccine strategies. In this work, the development and optimization of HIV-1 VLP production protocol by transient Gag gene expression in HEK 293 mammalian cell suspension cultures, with free serum and without animal origin compounds is reported. To facilitate the study of this process the fusion protein Gag-GFP is used as reporter. Transient gene expression (TGE) is normally used in the development stages, where it is necessary to have a minimum amount of product faster and easier for functional and structural assays. One of the intrinsic limits of TGE is that episomal DNA is lost as cells divide; this causing that production phase is reduced to less than 96 hours post transfection, thus limiting the overall productivity capacity. With the aim to overcome these limitations, a new alternative to transient transfection has been studied in this work, named as: Extended Gene Expression (EGE). With these optimized protocol a production 3.91 fold and 100% of completely ensemble VLP are obtained respect the standard transient transfection methodology. Secondly, a kinetic study of the DNA/PEI complex entry was performed at intracellular level. Firstly, it was observed how DNA/PEI complexes apparently are introduced in HEK 293 cells between the first 60 minutes post transfection. A second series of experiments where the transient transfection was analyzed by confocal microscopy resolved that DNA/PEI complexes get completely attached to the membrane during the first 60 minutes but they last a superior time to entry into the cells (5 hours). Finally, the first step for the performance of the Extended Gene Expression in bioreactor was studied by batch processes. Two batches in 0.5L bioreactor were performed with different conditions but no normal growth was observed in bioreactor compared with the growth in vitro (2·106cells /mL y 6·106 cells/mL, respectively). The further step in this optimization process will consist on the achievement of the proper conditions for HEK 293 cells to grow and consecutively the EGE application by perfusion in bioreactor.

[CA] Les Virus-like particles (VLPs) són constructes biològics que mimetitzen la estructura natural del virus però sense ser infectives ja que no contenen la informació genètica d’aquest. Per aquest motiu, són candidates molt prometedores per al desenvolupament de vacunes de nova generació. En aquest treball, es desenvolupen VLPs per a l’obtenció d’una nova vacuna contra el HIV-1. Aquesta vacuna està basada en l’expressió transitòria de la proteïna Gag en la línia cel·lular HEK 293 en suspensió, en medi lliure de sèrum i components d’origen animal mitjançant complexes de DNA/PEI. Per a facil·litar el seguiment d’aquest procés, la proteïna Gag és troba fusionada amb GFP. L’expressió transitòria s’utilitza habitualment en les primeres fases del desenvolupament d’un producte on es requereixen petites produccions per a estudis funcionals i estructurals. La limitació d’aquest sistema es que, al trobar-se el DNA en forma episomal, a mesura que la cèl·lula es divideix les còpies van perdent-se. Açò fa que la fase productiva es limite a 96 hores i per tant, la producció final obtinguda siga menor. Per a millorar les limitacions mencionades, en aquest treball s’estudià una nova aproximació a la transfecció transitòria anomenada: Extended Gene Expression (EGE). Amb aquest protocol, s’obtingueren produccions 3.91 vegades majors que les obtingudes pel sistema de transfecció transitòria estàndard, amb un 100% de HIV-1 VLPs completament ensamblades. S’estudià la cinètica del procés d’expressió transitòria a nivell intracel·lular. Primerament, s’observà com els complexes pareixen entrar en els primers 60 minuts post transfecció. Posteriorment s’estudià el procés d’expressió transitòria pel microscopi de fluorescència, i es comprovà com el DNA/PEI s’adheria a la membrana cel·lular des que eren afegits al medi, però l’entrada a les cèl·lules tenia una duració superior ( 5 hores). Finalment, es realitzà el primer pas per a l’aplicació del nou sistema d’expressió EGE en bioreactor. Es van realitzar una sèrie de cultius en batch en bioreactor de 0.5 L. Lamentablement, la concentració arribada al bioreactor es notòriament inferior a la observada in vitro (2·106cèl·lules /mL i 6·106 cèl·lules/mL, respectivament). Per tant, el proper pas en el procés d’optimització per a la producció de HIV-1 VLPs consistirà en trobar les millors condicions per a correcte creixement de les HEK 293 en bioreactor i per a la posterior aplicació de la EGE en perfusió.

[ES] Las Virus-like particles (VLPs) son constructos biológicos que mimetizan la estructura natural del virus pero sin ser infectivas ya que no contienen la información vírica en su interior. Por este motivo, son candidatas muy prometedoras para el desarrollo de vacunas de nueva generación. En este trabajo se desarrollan VLPs para la generación de una vacuna contra el HIV-1. Esta vacuna está basada en la expresión transitoria de la proteína Gag en la línea celular HEK 293 en suspensión, en medio libre de suero y de componentes animales. La transfección transitoria (TGE) se lleva a cabo mediante la utilización de complejos DNA/PEI. Para facilitar el seguimiento de este proceso y cuantificar el producto final, se fusionó la proteína Gag con GFP. La TGE se emplea habitualmente en las fases de desarrollo de un producto donde se requieren pequeñas cantidades del mismo para estudios funcionales y estructurales. La limitación de este sistema es que al encontrarse el DNA en forma episomal, cuando las células se dividen, las copias de éste se pierden, limitando la fase productiva a 96 horas, y por tanto la producción final conseguida. Para prolongar las limitaciones mencionadas, en este trabajo se ha estudiado una nueva aproximación a la transfección transitoria, denominada Extended Gene Expresión (EGE). Con este nuevo protocolo, se pueden alcanzar producciones 3.91 veces mayores que con el sistema de producción transitoria estándar, con un 100% de HIV-1 VLPs completamente ensambladas. Se estudió la cinética del proceso de expresión transitoria a nivel intracelular. En primer lugar, se observó como los complejos parecían entrar en los primeros 60 minutos post transfección. Posteriormente se estudió el proceso de expresión transitoria mediante microscopio confocal, y se comprobó como los complejos de DNA /PEI se adherían a la membrana celular desde su misma adición pero que la entrada en las células tenia una duración superior (5 horas). Finalmente, se realizó el primer paso para la aplicación del nuevo sistema de expresión EGE en biorreactor. Se realizaron una serie de cultivos en batch en biorreactor de 0.5 L. La concentración alcanzada en el biorreactor es considerablemente inferior a la conseguida en el mismo cultivo en Erlenmeyer (2·106células /mL y 6·106 células/mL, respectivamente). Así, en trabajos futuros deben optimizarse las condiciones para el crecimiento de las HEK 293 en biorreactor y la posterior aplicación de la EGE en perfusión.