Unraveling Thioredoxin-80 (Trx80) and Aββ relationship in Alzheimer’’s disease

Abstract

[EN] A Project at Karolinska Institutet (KI), Huddinge (Sweden), is in this master thesis summarized. Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia in the world and one of the pathological hallmarks seen in AD patients is the formation of amyloid plaques assembled of amyloid-β peptide (Aβ) aggregates. The events that drive to Aβ42 aggregation are unknown, although an increase on Aβ42 production, decrease of Aβ42 degradation or a reduction of its clearance are some processes that appear to be involved. In this context, one of the challenges of AD research is to find the way to decrease Aβ42 levels in the brain. Inhibition of Aβ42 aggregation or removing of extra- and intra-cellular Aβ pools are two attractive strategies for this purpose. Our group has been the first to describe the presence of Thioredoxin-80 (Trx80) in the brain. Trx80, generated through the cleavage of Thioredoxin-1 (Trx1) by α-secretases, is present in an aggregated form in neurons and is drastically decreased in AD brain. In vitro studies have shown that Trx80 is able to inhibit Aβ42 aggregation and protects against Aβ toxicity in SH-SY5Y cells. Thus, a reduction in Trx80 production would result in increased Aβ42 aggregation and enhanced neuronal vulnerability. Up to date, Trx80 seems to be one of the few endogenous Aβ42 anti-aggregants described and previous results suggest a great importance of Trx80 in Aβ42 degradation. However, the molecular mechanisms that link Trx80 with Aβ42 have not been described. The general aim of this master project is to help to shed light on Trx80 function in the brain, since its biochemical and molecular function and its possible role in AD pathology are not understood. In the first part of this work, we describe the design and generation of recombinant Trx80 that will be used to pursue future molecular and protein structure studies. We successfully generate six different Trx80 constructs and Trx80 was expressed and purified. In our second aim we used cell viability assays in SH-SY5Y cells to prove that the generated Trx80 peptide was functional. We observed that the three Trx80 peptides had Aβ42 anti-polymerization and anti-toxicity effects, as previously reported for Trx80, resulting that the peptide was functional. Moreover, we showed for the first time, that Trx80 had a mitogenic effect in SH-SY5Y cells. Next, we went to create Trx80 over-expressing cells as a tool to study Trx80 function. Using these cells transiently over-expressing Trx80, we found that Trx80 was mainly present in the extracellular media. Moreover, we focused on the function of Trx80 as a possible anti- Aβ42 aggregation and we examined the levels of one of the major enzymes involved in extracellular Aβ degradation. The final aim concerned the study of Trx80 as a possible chaperone that acts to prevent the aggregation of β-amyloid species that cause many neurodegenerative diseases. Using insulin as a model of β-amyloid fibrillation, we found that Trx80 prevents insulin aggregation in vitro and that rescues its functional activity in SH-SY5Y cells. Data collected in this study suggest that this effect may also be seen in other amyloid proteins that aggregates and which are a common feature of many neurodegenerative diseases. In conclusion, our results show that Trx80 exhibits several interesting characteristics supporting its singular role and a close relation with Aβ42 in AD. The results obtained in this work will help to acquire a deeper knowledge that eventually will answer remaining questions about Trx80 function in AD brain.

[ES] En este trabajo fin de máster se resume el estudio realizado durante mi estancia en Karolinska Institutet (KI), Huddinge (Suecia). Actualmente la enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo. Desde el punto de vista bioquímico, la presencia de placas seniles principalmente formadas por agregados del péptido β-amiloide (βA) es uno de los elementos más importantes asociados a la enfermedad. Los acontecimientos que conducen a la acumulación progresiva del péptido βA en el cerebro por ahora se desconocen, aunque los principios moleculares que subyacen a la producción y degradación de βA son algunos procesos que parecen estar implicados. En este contexto, uno de los mayores retos de la investigación en la EA es encontrar la manera de disminuir los niveles de βA42 en el cerebro. La inhibición de la agregación de βA42 o la eliminación de agregados del péptido intra- y extracelulares son estrategias muy atractivas para lograr este propósito. Recientemente, en un artículo publicado en EMBO Molecular Medicine, nuestro grupo ha descrito por primera vez la presencia de Tiorredoxina-80 (Trx80) en el cerebro. Trx80, es una proteína de 80 aminoácidos generada a través del corte proteolítico, por α-secretasas, de Tiorredoxina-1 (Trx1). Se ha observado que Trx80 se encuentra formando agregados en las neuronas y que sus niveles están drásticamente disminuidos en la EA. Estudios realizados in vitro demuestran que Trx80 es capaz de inhibir la agregación de βA42 y proteger contra la toxicidad de βA42 en células de neuroblastoma, SHSY5Y. Por tanto, una disminución en la producción de Trx80 daría lugar a un aumento de la agregación de βA42 y a una mayor vulnerabilidad neuronal. Trx80 es uno de los pocos anti-agregantes endógenos descritos hasta la fecha, y además nuestros resultados sugieren que tiene una gran importancia en la degradación de βA42. Sin embargo, los mecanismos moleculares que relacionan Trx80 con βA42 no han sido descritos. En este proyecto el objetivo general es arrojar luz sobre la función de Trx80 en el cerebro, ya que tanto su función bioquímica y molecular como su posible papel en la patología de la EA se desconocen. El primer objetivo de nuestro trabajo describe el diseño y la generación de construcciones de Trx80 recombinante que se utilizará en futuros estudios. Se lograron generar con éxito seis construcciones diferentes y el péptido de Trx80 fue expresado y purificado. Para lograr nuestro segundo objetivo se utilizaron ensayos de viabilidad celular en SH-SY5Y, para demostrar que el péptido de Trx80 que generamos era funcional. Observamos que Trx80 protegía contra la toxicidad de βA42, tal y como se había observado en estudios previos con otro péptido de Trx80. Por otra parte, hemos demostrado por primera vez, que Trx80 tiene un efecto mitogénico en las células SH-SY5Y. A continuación, se crearon células que sobre-expresaban Trx80 con el objetivo de ser una herramienta para estudios de la función de Trx80. En dichas células observamos que Trx80 se encuentra principalmente en el medio extracelular. Por otra parte, nos centramos en la función de Trx80 como molécula inhibitoria de la agregación de βA42, y se examinaron los niveles de una de las principales proteínas implicadas en la degradación de βA42 extracelular. Finalmente estudiamos Trx80 como una posible chaperona que actúa para evitar la agregación de especies de β-amiloide, causantes de muchas enfermedades neurodegenerativas. Para ello, se realizaron estudios de agregación con Trx80 y utilizando insulina como modelo de especie β- amiloide. Los resultados obtenidos muestran que Trx80 previene la agregación de insulina in vitro y que rescata su actividad funcional en células SH-SY5Y. Los datos recogidos en este estudio sugieren que este efecto característico de Trx80 también se pueden observar en otras proteínas amiloides, cuya formación de agregados es una característica común de muchas enfermedades neurodegenerativas. En conclusión, nuestros resultados muestran que Trx80 presenta varias características interesantes que apoyan un papel singular y una estrecha relación con el péptido βA42 en la EA. Aunque el presente trabajo ayudará a entender mejor la función de Trx80 en la EA, necesitamos seguir investigando y conociendo mejor nuestro cerebro.